ГЛАВА 20

нечная плотность маркеров равнялась 0,7 сМ (4000 сМ/5826 локусов), что больше ожидаемой в 1995 г. плотности карты 2-5 сМ. К 1996 г. было запланировано построение физической карты, основанной на STS, с разрешением 300 т. п. н., то есть един STS-сайт должен был приходиться на каждые 300 т. п. н. ДНК человека. Однако уже в 1995 г. была построена полная физическая карта с разрешением 200 т. п. н.

Успехи в оптимизации технологии секвенирования ДНК вполне ощутимы, но не столь эффектны. Стоимость секвенирования пары оснований снизилась с 5 долл. США в 1990 г. до 0,3 долл. в 1996 г. Скорость секвенирования возросла с 10 000 оснований в день в 1990 г. до 50 000 в 1996 г. К 1998 г. предполагается секвенировать 80 м. п. н., или 2,5%, генома человека. Если не произойдет никаких кардинальных изменений, то при помощи «фабрики» из 30 автоматических секвенаторов, работающих круглые сутки, и полного набора физических карт космидных клонов можно будет секвенировать примерно 3000 м. п. н. ДНК за 6 лет, потратив на это - 900 млн. долл. США. Какие-то время и средства придется потратить еще на проверку ошибок и получение окончательной последовательности. Однако, прежде чем приступать к реализации столь крупномасштабного проекта, ученые пытаются добиться значительного повышения скорости секвенирования при помощи автоматических флуоресцентных секвенаторов, в которых используется метод Сэнгера. Кроме того, предпринимаются поиски других способов быстрого секвенирования ДНК.

Чтобы регулировать работу над различными аспектами всей программы, HGP распределяет финансы между разными исследовательскими группами. В большинстве случаев ответственность за создание генетических и физических карт конкретной хромосомы делят между собой крупные центры и небольшие лаборатории, которые сотрудничают друг с другом. Некоторые из наиболее крупных исследовательских институтов занимаются укомплектованием данных о генетических и физических картах генома. В результате молекулярно-генетических исследований генома человека появляется огромное количество новых данных о полиморфных зондах, STS-клонах, содержании генетических, физических и объединенных карт, рестрикционных фрагментах, геномной дактилоскопии и нуклеотидных последовательностях ДНК. Эти данные необходимо собирать, упорядочивать, хранить, объяснять, сравнивать, объединять и предоставлять другим исследователям как в исходном, так и в окончательном виде. Эффективное использование этой информации было бы невозможно без компьютерного обеспечения, включающего в себя базы данных, системы управления базами данных, алгоритмы математического моделирования и программы автоматизации экспериментов. Область знаний, которая занимается созданием численных методов обработки информации, называется информатикой. Биоинформатика имеет дело с компьютерным анализом и управлением биологической информацией.

В рамках программы HGP, касающейся усовершенствования компьютерных технологий, достигнуты значительные успехи в создании компьютерных программ, позволяющих проводить всестороннюю обработку данных по геному человека. Созданы электронные сайты, где специалисты и общественность могут получить информацию о содержании различных хромосомных карт, включая их полное графическое изображение, о методах исследования генома и программном обеспечении. Например, WWW-сайт Государственного центра по изучению генома человека в США (http://www.nhgri.nih.gov/index.html) содержит информацию о программе «Геном человека» и множество ссылок на другие центры, занимающиеся этой проблемой.

С самого начала своего существования HGP должна была решать этические, правовые и социальные проблемы, связанные с картированием и секвен ированием генома человека, вырабатывать стратегию, тактику и разрабатывать законопроекты, гарантирующие ответственное использование информации по генетике человека. На самом деле HGP не ставит каких-либо принципиально новых этических, правовых или социальных вопросов, которые не возникали бы при проведении медико-генетических исследований в целом. Однако реализация HGP неизбежно приведет к идентификации большого числа генов различных заболеваний и к определению последовательности многих из них, и эта

Молекулярная генетикачеловека 479

информация будет использоваться при разработке ДНК-диагностических тестов.

Здесь возникает множество поводов для беспокойства. Не будет ли генетическая информация использоваться для дискриминации людей при медицинском страховании, приеме на работу или иммиграции? Не приведет ли ее доступность к социальному неравенству? Все ли меры приняты, чтобы сохранить конфиденциальность персональной генетической информации? Как найти баланс между нуждами личности и общества? Обладают ли частнопрактикующие врачи и врачи, работающие в клиниках, достаточными знаниями по медицинской генетике, чтобы они могли разъяснить пациентам смысл конкретного генетического теста? Сможет ли генетическое консультирование уменьшить обеспокоенность обратившегося? Не скажется ли отрицательно доступность генетической информации на семейных отношениях? Можно ли надеяться на то, что удастся получить согласие на проведение диагностического теста у достаточно осведомленного пациента? Следует ли предлагать тестирование в том случае, когда данное наследственное заболевание неизлечимо? Как повысить образовательный уровень населения, чтобы оно понимало значение генетической информации? На эти и многие другие вопросы, возникающие при изучении генетики человека, нет однозначных ответов. В США в рамках подпрограммы по изучению этического, правового и социального аспектов генетических исследований организован целый ряд мероприятий: разработаны обучающие программы, проводятся семинары и выставки для студентов, учителей, врачей, общественности, адвокатов и судей; исследована возможность генетического тестирования муковисцидоза и наследственных форм рака молочной железы, яичников и толстой кишки, созданы две комиссии (по генетической информации и страхованию; по генетическому тестированию) для исчерпывающего изучения конкретных вопросов; разрабатываются предложения для выработки федеральных законов США, которые обеспечивали бы конфиденциальность генетической информации, получаемой при идентификации личности.

На основе этой программы и других исследований были сформулированы пять основных

принципов, которыми следует руководствоваться при использовании генетической информации и в работе генетических консультаций: право на автономию, конфиденциальность, справедливость, беспристрастность и качество. Концепция права на автономию в данном случае означает необходимость соблюдения прав человека, обращающегося в генетическую консультацию. Например, генетическое тестирование должно проводиться добровольно и только после того, как пациент в достаточной степени информирован; тестированию должны подвергаться лишь лица, относящиеся к группе риска; тестируемые должны сами решать, будут ли они знакомиться с результатами теста. Консультируемые должны быть хорошо осведомлены о всех особенностях теста: его прогностической ценности, медицинских аспектах, характере терапии, если она возможна.

Обычно считается, что генетическая информация отличается от других видов личностной информации, поэтому необходимо предусмотреть особые меры предосторожности, гарантирующие ее конфиденциальность. Справедливость и беспристрастность -- это довольно близкие понятия. Достигнуто соглашение, что генетическое консультирование должно быть доступно всем, кто в нем нуждается. Как и в случае социальных и медицинских программ, необходимо защитить права умственно неполноценных пациентов и детей. Что касается качества, то тестирование должны проводить высококвалифицированные сотрудники, используя при этом надлежащие методы и средства; все этапы должны соответствующим образом контролироваться, чтобы гарантировать правильность их использования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучая родословные семей, представленных несколькими поколениями, члены которых имеют четко выраженную патологию, можно определить тип наследования многих генетических заболеваний. Зная характер наследования в семьях, можно установить, является ли данное генетическое заболевание аутосомно-доминантным, аутосомно-рецессивным, Х-сцеп-

480 ГЛАВА 20

ленным доминантным или Х-сцепленным рецессивным. В случае Х-сцепленного заболевания его ген расположен на Х-хромосоме, для ау-тосомных болезней хромосомная локализация гена неизвестна. Чтобы картировать ген в специфическом районе хромосомы, можно идентифицировать сцепленные с ним маркерные сайты, используя для этого метод ПДРФ и STRP-картирование. Для оценки сцепления между маркерным сайтом и геном заболевания используют метод максимального правдоподобия. Порядок расположения ПДРФ- и STRP-сайтов на хромосоме определяют при помощи анализа наследования гаплотипов в группе семей, представленных тремя поколениями и имеющих большое количество детей (СЕРН-семей), Кроме того, порядок расположения на хромосоме уникальных сайтов, идентифицируемых при помощи ПЦР (STS), можно проверить картированием с использованием радиационных гибридов. Физические карты хромосом (контиги) строят на основе геномных библиотек, содержащих крупные (YAC, ВАС и РАС) и небольшие (космиды, Р1 и λ) фрагменты ДНК человека, используя STS-картирование или другие подходы, в том числе геномную дактилоскопию. Транскрипционные карты состоят из участков кДНК и маркерных экспрессируемых последовательностей (EST), расположенных вдоль хромосомы. Построение генетических, физических и транскрипционных карт облегчает идентификацию и характеристику генов заболеваний.

Аутентичность обнаруженного гена человека можно считать доказанной, если у больных индивидов в нем найдены изменения, отсутствующие в генах здоровых лиц. Для выявления мутаций часто используют анализ конформат шинного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP).

Для идентификации нужного гена человека используют четыре метода, В первом из них, функциональном картировании, на основе данных о генном продукте синтезируют зонды для скрининга кДНК-библиотеки. Положительный кДНК-клон, содержащий кодирующую область гена-мишени, используют для отбора геномных клонов и характеристики гена в целом. Второй подход, кандидатное картирование, основывается на выборе генов, которые по имеющимся данным могут отвечать за данное генетическое заболевание. В этом случае проводят поиск мутаций в генах-кандидатах у больных и здоровых индивидов и по результатам поиска делают вывод, какой из них является геном заболевания. Третий подход, позиционное картирование, применяют в тех случаях, когда ничего не известно ни о возможном гене заболевания, ни о его продукте. Этот подход весьма трудоемок и имеет множество модификаций. Сначала, используя ПДРФ- или STRP-зонды и данные о семьях с исследуемым наследственным заболеванием, определяют район хромосомы, в котором локализован искомый ген. Затем с помощью зондов, специфичных в отношении тесно сцепленных с ним маркеров, выявляют клоны, охватывающие район локализации гена заболевания. Проверяют геномные клоны или полученные из них субклоны на наличие в них экзонов. Используя данные о нуклеотидных последовательностях различных экзонов, в той или иной степени соответствующих нуклеотидной последовательности гена заболевания, разрабатывают стратегию поиска мутаций. Четвертый подход, позиционно-кандидатное картирование, состоит в картировании гена заболевания в определенном районе хромосомы, просмотре функциональных генов и маркерных экспрессируемых последовательностей, локализованных в том же хромосомном районе, и выборе тех из них, которые могут являться искомым геном. Чтобы определить, какой именно из генов-кандидатов является таковым на самом деле, используют мутационный анализ.

«Геном человека» — это широкомасштабная исследовательская программа, конечной целью которой является полное секвенирование генома человека. Различные ее направления включают построение генетических и физических карт всех хромосом человека с высоким разрешением; секвенирование геномов различных модельных организмов типа Е. coli, С. elegans, S. cerevisiae, M. musculus и A. thaliana; создание компьютерных технологий для обработки и анализа данных по генетическому и физическому картированию и секвенированию ДНК; информирование общественности по всем проблемам, связанным с получением и использованием данных по генетике человека, изучение этиче-

Молекулярная генетикачеловека 481

ских, правовых и социальных аспектов генетических исследований. На этом пути уже достигнуты впечатляющие успехи, и есть основания полагать, что геном человека будет секвенирован к 2005 г.

ЛИТЕРАТУРА

Bellane-Chantelot С., В. Lacroix, F. Ougen, A, Billault, S. Beaufils, S. Bertrand, L Georges,

F. Gilbert, I. Gros, G. Lucotte, L. Susini, J. Codani, P. Gesnouin, S. Pook, G. Vaysseix, J. Lu-Kuo, T. Ried, D. Ward, L Chumakov,

D. Le Pastier, E.Barillot, D. Cohen. 1992. Mapping the whole human genome by fingerprinting yeast artificial chromosomes. Cell 70:1059-1068.

Botstein D., R. L. White, M. Skolnick, R. W. Davis.1980. Construction of a genetic map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am, J. Hum. Genet. 32: 314-331.

Chumakov L M., P.Rigault, L Le Gall, С. Bellane-Chantelot, A. Billault, S. Guillou, P.Soularue,

G. Guasconi, E. Poullier, I. Gros, M. Belova, J,Sambucy, P. Gervy,I¹. Gilbert, S. Beaufils, H. Bui, C. Massart, M. De Tand, F. Dukasz, S. Lecoulant, P. Ougen, V. Perrot,M. Saunier,

C. Soravito, R. Bebouaylla, A.Cohen-Akenine,

E. Barillot, S, Bertrand, J. Codani, D. Caterina, I.Georges, B. Lacroix, G. Lucotte, M. Sahbatou, C. Schmit, M.Sangouard, E. Tubacher, C. Dib, S. Faure, C. Fizames, G.Gyapay, P. Millasseau, S, Nguyen,

D. Muselet, A. Vignal, J. Morissette, J. Mennjnger, J. Lieman, T. Desay, A. Banks, P. Bray-Ward, D. Ward, T. Hudson, S. Gerety, S. Foote, L.Stein, D, C. Page, E.S. Lander, J. Weissenbach, D. Le Paslier, D. Cohen,1995. A YAC contig map of the human genome. Nature (London) 377(Suppl.): 175-297.

Collins F.S. 1995. Positional cloning moves from perditional to traditional. Nat. Genet. 9: 347-350.

Collins F., D.Galas. 1993. A new five-year plan for the U.S. Human Genome Project. Science 262: 43-46.

Cooperative Human Linkage Center (CH LC): J. C. Murray, K. H. Buetow, J. L. Weber,S. Luihvigsen, T. Sclierpbkr-llertdcnia, P. Manion,

J. Quillen, V. C. Sheffield, S. Süden, G.M. Duyk; Genethon: J. Weissenbach, G, Gyapay, C. Dib, J, Morissette, G. M. Lathrop, A. Vignal; University nf Utah: R. White, N. IVfatsunami, S. Gerken, R. Mells, H. Albertsen, R. Plaetke, S. Odelberg; Yale University: D. Ward; Centre d'Etude du Polymorphisme Humain(СЕРН): J. Dausset, D. Cohen, H. Cann,1994. A comprehensive human linkage map with centimorgan density. Science 265: 2049-2054.

Сох D. R., M. Burmeister, E. R. Price, S. Kim, R. M. Myers.1990. Radiation hybrid mapping: a somatic cell genetic method for constructing high-resolution maps of mammalian chromosomes. Science 250; 245-250.

Fickett J, W.1996, Finding genes by computer: the state of the art. Trends Genet. 12: 316-320.

Green E. D., P. Green.1991. Sequence-tagged site (STS) content mapping of human chromosomes: theoretical considerations and early experiences. PCR Methods Appi. 1: 77-90.

Grompe M.1993. The rapid detection of unknown mutations in nucleic acids. Nat. Genet. 5: 111-120.

Guyer M. S., F. S. Collins.1995. How is the Human Genome Project doing, and what have we learned so far? Proc. Natl. Acad Sei. USA 92: 10841-10848.

Cyapay G., J. Morissette, A, Vignal, C. Dib, C.Fizames, P. Millasseau,S. Marc, G. Bernardi, M. Lathrop, J.Weissenbach, 1994. The 1993—1994 Genethon human genetic linkage map. Nat. Genet. 7: 246-287.

Hudson T. J., L. D. Stein, S. S. Gerety, J. Ma,

A. B. Castle, J. Silva, D. K. Slonim, R. Baptista, L.Kruglyak, S. Xu, X.Hu, A. M. E. Colbert, C.Rosenberg, M. P. Peeve-Daly, S. Rozen, L Hui, X. Wu, C. Vestergaan), K. M. Wilson, J. S. Bae, S, Maitra, S. Ganiatsas, C. A. Evans, M. M. DeAngelis, K. A. Ingalls, R. W.Nahf, L. T. Horton, M. O. Anderson, A. J. Collymore, W. Ye, V. Kouyoumjian, I. S. Zemsteva, J.Tarn, R. Devine, D. F. Courtney, M. T, Renaud, H. Nguyen, T. O'Connor, C. Fizames, S. Faure, G.Gyapay, C. Dib, J. Morissette, J.B. Orlin,

B. W. Girren, N. Goodman, J. Weissenbach, T. L. Hawkins,S. Foote, D. C. Page, E. S. Lander.1995. An STS-based map of the human genome. Science 270: 1945-1954.

482 ГЛАВА 20

Knoppers B. M., R. Chadwick. 1994. The Human Genome Project: under an international ethical microscope. Science 265: 2035—2036.

Leppert M., V. E. Anderson, T. Quattlebaum, D. Stauffer, P. O¹ Cornell, Y. Nakamura, J.-M. Lalouel, R. White. 1989. Benign familial neonatal convulsions linked to genetic markers on chromosome 20. Nature (London) 337:647-648.

Ott J. 1992. Analysis of Human Genetic Linkage. Johns Hopkins University Press, Baltimore, Md.

Poustka A., T. M. Pohl, D. P. Barlow, A.-M. Frischauf, H. Lehrach. 1987. Construction and use of human chromosome jumping libraries from Notl-digested DNA. Nature (London) 325: 353-355.

Schüler G. D., M. S. Boguski, E. A. Stewart, L· D. Stein, G. Gyapaj, К. Rice, R. F,. While, P. Rodriguez-Tomé, A. Aggarwal, E. Bajorek, S. Bentolila, В. И. Birren, A. Butler, A. B. Castle, N. Chiannikulchai, A. Chu,

C. Clee, S. Cowles, P. J. R. Day, T. Dibling, N. Drouot, I. Dunham, S. Duprat, С East, С. Edwards, J.-B. Fan, N. Fang, С. Fïzames, С. Garrett, L. Green,

D. Hadley, M. Harris, P. Harrison, S. Brady, A. Hfcks, E, HoUoway, L· Hui, S. Hussain, C. Louis-DH-Sully, J. Ma, A. MacGilvery, C. Mader, A. Maratukulam, T. C. Matise, K. B. McKuskk, J. Morissette, A. Mungafl, D. Musekt, H. С Nasbaum, D. C. Page, A. Peck, S. Perkins, M. Piercy, F. Qin, .1. Quackenbush, S. Ranby, T. Reif, S. Ktizcn, C. Sanders, X. She, J. Suva, D. K. Slonim, C. Sodertund, W.-L. Sun, P. Tabar, T. Thangarajah, N. Vega-Czarny, D. Voürath, S. Voytkky, T. Wümer, X. Wu, M. D. Adams, C. Auffray, N. A. R. Walter, R. Brandon, A. Dehajia, P. N. GoodfeUow, R. Houlgatte, J. R. Hudson, Jr., S. E. Ide, K. R. lorio, W. Y. Lee, N. Seki, T. Nagase, K. Ishikawa, N. Nomura, С. Phillips, M. H. Pdymeropoulos, M. Sandusky, K. Schmitt, R. Beny, K. Swanson, R. Torres, ,ï. С Venter, J. M. Sîkela, J. S. Beckmann, J. Wcissenbach, R. M. Myers, D. R. Сох, M. R. James, D. Bentley,