Повышение устойчивости растений к болезням и вредителям.

Устойчивость растений к фитопатогенам.Наибольший урон растениям наносят грибные, бактериальные и вирусные патогены. В растении существуют защитные механиз­мы, которые в большей или меньшей степени (в зависимости от устойчивости растений) начинают действовать в ответ на про­никновение фитопатогенов в клетку. Начинается син­тез соединений, вызывающих гибель патогенов. Примером могут служить специфические белки PRP (pathogen related proteins). Из них наиболее изучены ферменты хитиназы и β-1,3-глюконазы, которые угнетают рост грибов и некоторых видов бактерий, раз­рушая их клеточные стенки.

Применение методов генетической инженерии, использующих естественные защитные механизмы, позволяет получать трансгенные растения, устойчивые к грибной, бактериальной и вирусной инфекции. Так, были получены трансгенные рас­тения табака и турнепса, в состав генома которых ввели ген хитиназы. Лабораторные и полевые испытания выявили большую ус­тойчивость трансгенных растений. В растения томатов был введен ген защитных пептидов редьки (дефензинов) rs, отвечающих за устойчивость к фитопатогенным грибам. Перспективны клонирование и перенос генов, кодирующих специфические бел­ки (small antibiotic-like proteins), содержащиеся в семенах многих растений. Эти белки защищают семена в период покоя и во время прорастания от грибных и бактериальных инфекций.

Успешно закончились эксперименты по повышению устойчивости табака к фитофторе (Phytophtora parasitica) путем встройке гена, кодирующего белок бета-криптогенин под промотором 35S вируса мозаики цветной капусты (один из самых эффективных промоторов). Трансгенные растения показали повышенную устойчивость к ряду рас данного гриба.

Другой подход к получению трансгенных растений, устойчи­вых к вирусной инфекции, состоит во введении в геном исходных растений гена оболочки вируса. Это приводит к ингибированию размножения вируса и снижению инфицированности. Благодаря такому подходу был получен стойкий антивирусный эффект у ра­стений табака, трансформированных геном оболочки вируса та­бачной мозаики (ВТМ).

Устойчивость растений к гербицидам.В настоящее время в сельском хозяйстве широко используют гербициды — химические соединения, применяемые для уничто­жения сорной растительности. Гербициды широкого спектра дей­ствия могут не только уничтожать сорняки, но и угнетать рост культурных растений. В связи с этим возникает необходимость в создании растений, устойчивых к этим веществам. Существует два подхода к решению этой проблемы: прямая селекция устойчивых к гербицидам мутантных форм растений, или мутантных клеточ­ных штаммов (клеточная селекция), и генно-инженерный метод, который состоит во введении в растения генов гербицид-резистентности растительного или бактериального происхождения.

Благодаря использованию методов генетической инженерии были созданы новые, устойчивые к различным гербицидам сельскохо­зяйственные культуры. В геном этих культур вводились мутантные гены, кодирующие синтез ферментов, на которые гербициды (атразин, биалофос, бромоксилин, имидазол) не оказывают негативного дей­ствия. Например, растения лядвенца рогатого (Lotus comiculatus) были трансформированы с помощью штамма А281/рСВЕ21. Эта бактерия содержит плазмиду со встроенным геном bar, кодирую­щим фермент, придающий устойчивость к гербициду биалофосу (фосфинотрицин). Трансгенные растения содержат ген bar и невосприимчи­вы к гербициду. Однако в тканях таких растений наблюдается накопление гербицидов, и использовать эти растения можно только в технических целях. Вместе с тем показано, что введение генов, кодирующих другие ферменты, позволяет проводить детоксикацию гербицидов, создавая, таким образом, растения, пригодные в пищу.

Изучая механизмы действия гербицидов, генетики выяснили, что чаще всего они действуют на какой либо один важный для растения фермент, прикрепляются к нему и тем самым ослабляют его работу. Это приводит к нарушению роста и развития растений, и они погибают. Установлено, что толерантность к гербицидам обусловлена мутацией одного гена. Основной механизм устойчивости связан с изменением последовательности аминокислот в той части молекулы фермента, в которой происходит его связывание с гербицидом. В результате гербицид не узнает свою «мишень» в структуре фермента, последний сохраняет свою функциональную активность, а организм становится толерантным к действию гербицида. Описанный механизм получил название «мутация мишени» и характерен для устойчивости к таким гербицидам, как Раундап (глифосат), сульфанилтиомочевина и др.

Гербицид глифосат относится к гербицидам общего действия. Его мишенью в растении является фермент EPSPS (енолпирувилшикимат-3-фосфат синтаза), который играет важную роль в синтезе ароматических аминокислот. Под действием глифосата неустойчивые к нему растения из-за недостатка ароматических аминокислот погибают в течение двух недель. Необходимо подчеркнуть, что глифосат не несет опасности для животных и человека, так как его «мишень» EPSPS имеется только у растений, грибов и бактерий.

В результате генетических исследований были обнаружены бактерии, у которых из-за точковой мутации произошла замена одной аминокислоты в области фермента EPSPS, где происходит его связывание с гербицидом глифосатом. Поэтому гербицид не может дезактивировать такой мутантный фермент, и бактерии устойчивы к его действию. В настоящее время выделены гены EPSPS с мутацией мишени от бактерий рода Agrobacterium (ген cp4), Salmonella (ген sm1) и др. Например, в более чем 1000 полученных трансгенных сортах сои, устойчивых к глифосату, встроен мутантный ген cp4 от почвенной бактерии Agrobacterium tumefascens. Для доставки гена EPSPS к хлоропластам (месту синтеза ароматических аминокислот) к нему присоединен фрагмент ДНК от петунии, кодирующий небольшой транзитный пептид. Таким образом, генетически модифицированные сорта сои отличаются от обычных тем, что у них фермент EPSPS, привнесенный от гена бактерии, не связывается с гербицидом, что делает эти сорта устойчивыми к глифосату. Хлоропластный транзитный пептид от петунии быстро разрушается в процессе переваривания и также не несет опасности для организма животных и человека.

Устойчивость растений к насекомым.Еще в 30е годы ХХ века было обнаружено, что бактерии Bacillus thurengiensis синтези­руют специфический белок — так называемый Bt-протеин (Bt-токсин, дельта-эндотоксин) высокотоксичный для насекомых. Попадая в кишечник насекомого, этот белок расщеп­ляется, образуя активную форму токсина. В результате насекомое погибает. Необходимо отметить, что Bt-протеин, выделенный из одного определенного штамма бактерии, способен убивать только определенный тип насекомых, например, жуков, и не действует на пчел, бабочек и др. Поэтому препараты, широко используемые в сельском и лесном хозяйстве для борьбы с различными насекомыми-вредителями в соответствии со спектром действия носят названия колептерин, лепидоцид, дендролин и др. Еще одним важным достоинством этих препаратов является их полная безопасность для здоровья как теплокровных и человека (пищеварительная система у них устроена иначе, чем у насекомых), так и для окружающей среды (высокая специфичность действия, быстро разрушаются под действием ультрафиолета, не способны накапливаться в растениях и почве, легко смываются с листьев). Однако, Bt-препараты способны защищать растения только очень короткое время и поэтому слабоэффективны.

Эта проблема была решена с помощью получения трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям.

Ген, кодирующий синтез Bt-протеина, был выделен из генома В. thurengiensis и в ряде случаев существенно модифицирован. Затем соединен с необходимыми регуляторными элементами и с помощью векторов встроен в различные виды сельскохозяйственных растений. Чаще всего используют выделенные из разных штаммов В. thurengiensis Bt-гены cryIA(b) для кукурузы, cryIIIA для картофеля, cryIA(с) для хлопчатника. При создании устойчивых к насекомым-вредителям сельскохозяйственных сортов генетики использовали не вирусные, а растительные промоторы. Так, в Bt-кукурузе использован промотор гена фосфоенолпируваткарбоксилазы самой же кукурузы, который обеспечивает экспрессию Bt-генов исключительно в зеленых тканях растений (листьях, стеблях). Именно благодаря этому Bt-протеина нет в зрелом зерне и силосе. Для создания Bt-картофеля использован промотор фермента рибулозо-1-5-бифосфаткарбоксилазы из растения арабидопсиса. Bt-ген, регулируемый этим фоточувствительным промотором, работает на свету в тысячу раз сильнее, чем в темноте, поэтому в клубнях Bt-протеина образуется в 100 раз меньше, чем в листьях. Эти данные свидетельствуют, что созданные трансгенные сорта картофеля и кукурузы не содержат в своем урожае продуктов привнесенного бактериального гена и соответственно, безопасны для человека и животных.