Получение трансгенных растений.

Перенос генов в растительные клетки, так же как в клетки живот­ных, и их встраивание в геном растений (трансформация) осуще­ствляются главным образом благодаря специфическим структу­рам — векторам. Некоторые виды агробактерий (Agrobacteria) могут заражать двудольные растения, вызывая об­разование опухолей — корончатых галлов. Одним из самых силь­ных индукторов опухолей служит почвенная бактерия A. tumefaciens. Способность этой бактерии к образованию опухоли связана с боль­шой внехромосомной плазмидой, получившей название Ti-плазмида (от англ. tumor inducing— индуцирующие опухоль). Ti-плазмиды — это естественные векторы для генов, обладающие всеми функциями, необходимыми для переноса, стабильного включе­ния и экспрессии генетической информации в растениях. Они имеют широкий круг хозяев. В бактериальных клетках Ti-плазмиды реплицируются автономно. Эти плазмиды различаются по типу кодируемых опинов —специфических аминокислот, которые используются бактерия­ми в качестве источников азота и углерода. Обычно встречаются плазмиды, кодирующие два типа опинов: либо октопин (октопиновая плазмида), либо нопалин (нопалиновая плазмида).

После заражения часть Ti-плазмиды встречается в хромосомах клеток растения-хозяина. Следовательно, A. tumefaciens встраива­ет часть своего генома в ДНК растительной клетки и заставляет ее таким способом изменять метаболизм, синтезируя вещества, не­обходимые для бактерий. Именно это свойство A. tumefaciens и послужило поводом для создания на основе Ti-плазмиды векто­ра, доставляющего необходимые гены в клетку.

Участок Ti-плазмиды, встречающийся в хромосомах раститель­ных клеток, называется Т-областью в бактерии и Т-ДНК в клет­ках растений. Т-область включает примерно 10% Ti-плазмиды и содержит гены, отвечающие за индукцию опухоли, синтез опи­нов и подавление дифференцировки (гормоннезависимый рост клеток). Важно отметить, что все гены, ответственные за перенос и интеграцию генов Т-области, находятся не в ней самой, а ря­дом — в области вирулентности — vir-области.

Т-области ограничены прямыми повторяющимися последова­тельностями, и любая ДНК, вставленная между этими повтора­ми, будет принята за Т-область и перенесена в растительную клетку.

Недостаток этих плазмид состоит в том, что некоторые гены, находящиеся в Т-ДНК, заставляют расти клетки растений незави­симо от гормонов, вносимых в питательную среду, на которой куль­тиви-руются данные клетки. В свя­зи с этим очень трудно регене­рировать нормальное растение из клеток, содержащих полную последовательность Т-ДНК. Дру­гой недостаток — большие раз­меры Ti-плазмиды, из-за кото­рых затруднены какие-либо ма­нипуляции с ней, поэтому вста­вить ген в плазмиду традицион­ными методами невозможно.

В настоящее время констру­ируются производные Ti-плазмиды, в которых оставляют регуляторный участок Т-области, а вместо ее структурных генов вшивают структурную часть гена, который надо ввести в растение. Такие гены с позиции их регене­рации безвредны для растений.

Существуют и другие бактерии (A. rhiwgenes), вызывающие уси­ленное образование корешков при заражении растений. За этот процесс ответственны содержащиеся в них так называемые Ri-плазмиды (от англ. root inducing — индуцирующий корни). Ri-плазмиды выгодно отличаются от Ti-плазмид тем, что они служат ес­тественными безвредными векторами, так как трансформирован­ные с их помощью растительные клетки сохраняют способность к морфогенезу и к регенерации здоровых растений. В связи с этим Ri-плазмиды в данный момент рассматриваются как более перс­пективные векторы.

В настоящее времяна основе Ti-плазмид конструируются и другие типы векторов (например, промежуточный и бинарный векторы).

Благодаря появлению специфического объекта — изолирован­ных протопластов, т. е. клеток, лишенных целлюлозной стенки, возник­лиметоды прямого переноса генов в растение. К таким методам можно отнести:

· трансформация растительных протопластов. Осуществляется благодаря комбинации методик кальциевой преципитации ДНК и слияния протопластов. Для трансформации может быть исполь­зован практически любой ДНК-вектор. Донорная ДНК может не содержать специальных биологических сигналов (vir-областей, пограничных областей Т-ДНК);

· культуру протопластов на начальной стадии ее роста заража­ют агробактериями, которые используют в качестве векторов;

· микроинъекции ДНК. Аналогичен методу микроинъекций животных клеток. Этот метод можно рассматривать как наиболее универсальный. Эффективность трансформации растительных клеток — 10-20 % независимо от типа вектора. Трансформация не видоспецифична, возможен перенос генов в любое растение;

· электропорация. Метод основан на повышении проницаемости биомембран за счет действия импульсов высокого напряжения. В результате молекулы ДНК проникают в клетки через поры в клеточной мембране;

· упаковка в липосомы. Это один из методов, позволяющих защитить экзогенный генетический материал от разрушения нуклеазами растительной клетки. Липосомы — сферические тельца, оболочки которых образованы фосфолипидами;

· метод биологической баллистики. Метод основан на напылении ДНК-вектора на мельчайшие ча­стички вольфрама, которыми затем бомбардируют клетки. Бом­бардировка осуществляется с помощью баллистической пушки за счет перепада давления. Часть клеток гибнет, а выжившие клетки трансформируются, затем их культивируют и используют для регенерации растений.