Получение антибиотиков на основе генно-инженерных технологий.

Продуктивность пенициллина у первого лабораторного штамма Penicillium chrisogenum составляла только 2 мг препарата на 1 л культуры и была явно недостаточной для промышленного производства антибиотика. Направленными воздействиями мутагенами, в сочетании с отбором наилучших продуцентов, удалось увеличить продуктивность гриба в 10 000 раз и довести концентрацию пенициллина в культуре до 2%. Путь повышения эффективности штаммов-продуцен-тов антибиотиков, основанный на получении мутаций, несмотря на колоссальные затратытруда, используется до настоящего времени.

Кроме того, получение и клинические испытания новых препаратов обходятся очень дорого, и в продажу поступают только 1-2%, которые имеют терапевтическую ценность и представляют экономический интерес. В этом отношении большие надежды возлагаются на технологии рекомбинантных ДНК. Во-первых, с их помощью можно создаватьновые антибиотики с уникальной структурой, оказывающие более мощное воздействие на определенные микроорганизмы с минимальными побочными эффектами. Во-вторых, генно-инженер-ные подходы могут использоваться для увеличения выходаантибиотиков и соответственно для снижения стоимости их производства.

Процесс биосинтеза одного антибиотика может состоять из десятков ферментативных реакций, так что клонирование всех генов его биосинтеза – задача не из легких. Однако, с помощью генетических или биохимических экспериментов можно идентифицировать, а затем выделить один или несколькоключевых ферментовбиосинтеза, определить их N-концевые аминокислотные последовательности и, исходя из этих данных, синтезировать олигонуклеотидные зонды. Этот подход использовался для выделения из P. chrysogenum генасинтетазы изопенициллина N. Этот фермент катализирует окислительную конденсацию 5-(L-а-аминоадипил)-L-цистеинил-D-валина в изопенициллин N, ключевое промежуточное звено в биосинтезе пенициллинов, цефалоспоринов и цефамицинов.

Новые антибиотикис уникальными свойствами и специфичностью можно получить, проводя генно-инженерные манипуляции с генами, участвующими в биосинтезе уже известных антибиотиков.

Одна из плазмид Streptomyces, pIJ2303, несущая фрагмент хромосомной ДНК S. coelicolor длиной 32,5 т.п.н., содержит все гены ферментов, ответственных за биосинтез из ацетатаантибиотикаактинородина. Эту плазмиду вводили либо в штамм АМ-7161 Streptomyces sp., синтезирующий родственный антибиотик медермицин, либо в штаммы В1140 или Tu22 S. violaceoruber, синтезирующие также родственные антибиотики гранатицин и дигидрогранатицин.

Каждый из 4-х антибиотиков формирует разный рН и соответнно цвет культуральной среды. Появление характерной окраски после трансформации штаммов АМ-7161, B1140 и Тu22 плазмидой, несущей гены, кодирующие ферменты биосинтеза актинородина, свидетельствует о синтезе в данных штаммах этого антибиотика.

Трансформанты штамма АМ-7161 Streptomyces sp. и штамма В1140 S. violaceoruber, содержащие плазмиду рIJ2ЗОЗ, синтезируют антибиотики, кодируемые и плазмидой, и своей хромосомной ДНК.

Однако, при трансформации штамма Тu22 S. violaceoruber плазмидой pIJ2303 наряду с актинородином синтезируется новый антибиотик – дигидрогранатиродин, а при трансформации штамма АМ-7161 Streptomyces sp. плазмидой pIJ2315 синтезируется еще один новый антибиотик – медерродин А.Эти новые антибиотики вероятно, образуются в том случае, когда промежуточный продукт одного пути биосинтеза служит субстратом для фермента другого пути.

Детально изучив генетические и биохимические составляющие биосинтеза поликетидного (образуюшихся в результате ферментативной конденсации карбоновых кислот)антибиотика эритромицина в клетках Saccharopolyspora erythraea, удалось внести специфические изменения в гены, ассоциированные с биосинтезом этого антибиотика, и синтезировать производныеэритромицина с другими свойствами.

Вначале была определена первичная структура фрагмента ДНК S. erythraea длиной 56 т.п.н., содержащего кластер генов ery. Затем двумя разными способами модифицирована эритромицинполикетидсинтаза. Для этого либо удаляли участок ДНК, кодирующий бета-кеторедуктазу, либо вносили изменение в участок ДНК, кодирующий еноилредуктазу. Эти эксперименты показывают, что если идентифицировать и охарактеризовать кластер генов, кодирующих ферменты биосинтеза определенного поликетидного антибиотика, то, внося в них специфические изменения, можно будет направленно изменять его структуру. Кроме того, вырезая и соединяя те или иные участки ДНК, можно перемещать домены поликетидсинтазы и получать новые поликетидные антибиотики.

С помощью генной инженерии можно не только создавать новые антибиотики, но и увеличивать эффективность синтеза уже известных. Лимитирующим фактором в промышленном производстве антибиотиков с помощью Streptomyces sp. часто является количество доступного клеткам кислорода. Вследствие плохой растворимости кислорода в воде и высокой плотности культуры Streptomyces его часто оказывается недостаточно, рост клеток замедляется, и выход антибиотика снижается. Используя методы генной инженерии, можно создать штаммы Streptomyces, более эффективно использующие имеющийся кислород.

Например, аэробная бактерия Vitreoscilla sp. синтезирует гомодимерный гемсодержащий белок, функционально подобный эукариотическому гемоглобину. Ген «гемоглобина» Vitreoscilla был выделен, встроен в плазмидный вектор Streptomyces и введен в клетки этого микроорганизма. После его экспрессии на долю гемоглобина Vitreoscilla приходилось примерно 0,1% всех клеточных белков S. coelicolor даже в том случае, когда экспрессия осуществлялась под контролем собственного промотора гена гемоглобина Vitreoscilla, а не промотора Streptomyces. Трансформированные клетки S. coelicolor, растущие при низком содержании растворенного кислорода, синтезировали в 10 раз больше актинородина на 1 г сухой клеточной массы и имели большую скорость роста, чем нетрансформированные. Этот подход можно использовать и для обеспечения кислородом других микроорганизмов, растущих в условиях недостатка кислорода.