Производство гормонов человека генно-инженерными методами.
Инсулин — гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний — сахарному диабету, который как причина смерти стоит на третьем месте после сердечнососудистых заболеваний и рака. Инсулин — небольшой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде одноцепочечного предшественника — препроинсулина, содержащего концевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид). При удалении сигнального пептида в клетке образуется проинсулин из 86 аминокислотных остатков, в котором А и В-цепи инсулина соединены С-пептидом, обеспечивающим им необходимую ориентацию при замыкании дисульфидных связей. После протеолитического отщепления С-пептида образуется инсулин.
Известно несколько форм сахарного диабета. Самая тяжелая форма, для лечения которой больному необходим инсулин (инсулинзависимая форма заболевания), вызвана избирательной гибелью клеток, синтезирующих этот гормон (клетки островков Лангерганса в поджелудочной железе). Форма сахарного диабета, для лечения которой инсулин не требуется, распространена чаще, с ней удается справляться с помощью соответствующих диет и режима.
Работы по генно-инженерному получению инсулина начались более 20 лет назад. В 1978г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках Е. coli (рис. 41). Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3'-концу гена фермента β-галактозидазы и вводился в векторную плазмиду (pBR322). Клетки Е. coli, трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента β-галактозидазы и А или В пептида инсулина, присоединенного к ней через остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианом пептид освобождается. Однако замыкание дисульфидных мостиков между образованными цепями инсулина происходило с трудом.
Рис. 41. Схема синтеза инсулина, с помощью трансформированной
бактерии E. coli.
В 1981г. синтезирован ген-аналог проинсулина — мини-С-про-инсулин, в котором 35-звенный С-пептид был заменен на сегмент из шести аминокислот: арг-арг-гли-сер-лиз-арг и показана его экспрессия в Е. coli.
В 1980 г. У.Гилберт с сотрудниками выделили мРНК инсулина из опухоли β-клеток поджелудочной железы крысы и с помощью обратной транскриптазы получили с нее кДНК. Полученную кДНКвстроили в плазмиду pBR322 Е. coli, в среднюю часть гена пенициллиназы. Рекомбинантная плазмида содержала информацию о структуре проинсулина. В результате трансляции мРНК в клетках синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллиназы и проинсулина, который выщепляли из такого белка трипсином.
Соматотропин (гормон роста человека ГРЧ) секретируется передней долей гипофиза. Впервые он был выделен и очищен в 1963 г. из гипофиза. Его недостаток приводит к заболеванию —карликовости (1 случай на 5000 человек). Гормон обладает видовой специфичностью. Ранее его получали из гипофиза трупов, но в недостаточном количестве. В настоящее время ГРЧ синтезируют методами генетической инженерии в специально сконструированных клетках бактерий. Будучи синтезированным в клетках Е. coli, ГРЧ содержит дополнительный остаток метионина на H2N-концe молекулы. Биосинтез ГРЧ из 191 аминокислотного остатка был осуществлен в 1979г. Сначала клонировали двунитевую кДНК; далее путем расщепления получали последовательность, кодирующую аминокислотный порядок гормона, за исключением первых 23 аминокислот, с фен до лей (23), и синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от первой до двадцать третьей со стартовым ATГ-кодоном в начале. Затем два фрагмента объединяли и подстраивали к паре lac-промоторов и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры, что составляет 100000 молекул гормона на клетку. Полученный гормон на конце полипептидной цепи содержал дополнительный остаток метионина и обладал значительной биологической активностью. С 1984 г. после серьезных клинических испытаний на токсичность компанией «Генетек» (Сан-Франциско) было начато широкомасштабное производство бактериального соматотропина.
Огромный интерес представляют выделение и синтез полипептида, обладающего полной биологической активностью гипоталамического рилизинг-фактора соматотропина (СТГ-РФ). Введение этого фактора способно компенсировать недостаток соматотропина. Таким образом, наличие СТГ-РФ и самого гормона, полученных в генетически сконструированных бактериальных клетках, очень важно для успешного лечения заболеваний, обусловленных недостатком этого гормона, и ряда патологических заболеваний, таких, как некоторые формы диабета, регенерация тканей после ожогов и др.
Дата добавления: 2015-08-14; просмотров: 3087;