Основные этапы получения трансгенных животных.

Получение трансгенных животных предусматривает ряд этапов:

· приготовление фрагмента ДНК, содержащего конкретный ген, для микроинъекции;

· получение оплодотворенных яйцеклеток (эмбрионов) млекопитающих;

· микроинъекция ДНК с помощью микропипетки в ядро (пронуклеус) оплодотворенной яйцеклетки млекопитающего (см. рис. 37, представленный ниже);

· пе­ресадка инъецированных эмбрионов в яйцеводы или после куль­тивирования в матку суррогатной матери;

· анализ экспрессии трансгена на уровне транскрипции и трансляции у родив­шихся потомков.

Генетический анализ родившихся трансгенных животных и полученного от них потомства показал, что, несмотря на инъек­цию ДНК на ранних стадиях, в трансгенных линиях могут появ­ляться так называемые мозаики. К мозаикам относят животных, которые помимо клеток, содержащих трансген, имеют еще и нетрансгенные клетки. Подсчитано, что около 30% первичных трансгенных животных, полученных методом микро­инъекции ДНК — мозаики, что затрудняет создание чистых транс­генных линий животных. Этим объясняется тот факт, что трансген не передается потомству с ожидаемой в соответствии с законами Менделя частотой 50%. Часть мозаиков вообще не может дать начало трансгенным линиям, так как у них отсутствует передача трансгена по наследству.

Этапы получения трансгенных мышей от введения фрагмента ДНК, содержащего несколько копий нужного гена (SRY) в пронуклеус

оплодотворенной яйцеклетки мыши с помощью микропипетки до получения взрослых особей, несущих чужеродную ДНК в каждом клеточном ядре представлены на рис. 37. В результате проведения этого эксперимента было показано, что именно ген SRY кодирует у мышей тестес детерминирующий фактор (TDF). У всех трансгенных самок с кариотипом ХХ половые органы под действием тестес детерминирующего фактора были мужского типа, включая четко выраженный пенис. Наличие гена SRY у трансгенных самок, полученных в данном эксперименте, было подтверждено Саузерн-блот анализом.

Метод микроинъекции ДНК в оплодотворенные яйцеклетки с 82-го года до настоящего времени остается наиболее популярным у исследователей, занятых получением трансгенных животных, несмотря на то, что он требует высокой квалификации и дорогостоящего оборудования. И это понятно, поскольку быстрота и надежность данного метода окупают все его недостатки.

В последние годы при создании трансгенных животных используют также эмбриональные стволовые клетки (ЕС-клетки), взятые из бластоцисты. ЕС-клетки можно культивировать in vitro, вводить в них с помощью трансдукции или ретровирусных векторов целевые трансгены и после трансформации инъецировать их в бластоцисту. Практическое достоинство этого методического подхода состоит в том, что он дает возможность проводить селекцию трансформированных ЕС-клеток по конкретному параметру. Это может быть число копий трансгена, его хромосомная локализация или характер экспрессии. Все полученные данным методом трансгенные животные – мозаики. Поэтому для получения чистых трансгенных мышей нужны дальнейшие скрещивания и отбор. Главные стадии получения трансгенных мышей при помощи технологии эмбриональных стволовых клеток представлены на рис. 38.