Послідовність HMBC

В експерименті НМВС вдається знайти кореляції через кілька хімічних зв'язків з використанням переваг високої чутливості детектування на протонах. Для її реалізації послідовність HMQC «настроюється» на одержання кореляцій через малі КССВ (Рис. 6.47а). Внаслідок великої схожості, ми обговоримо тільки моменти, що відрізняють НМВС від HMQC.

Рис. 6.47.Послідовність HMBC (a) без і (б) з імпульсними градієнтами поля. Послідовність близька до експерименту HMQC і використовує той самий шлях перенесення когерентності.

Настроювання експерименту полягає у виборі тривалості періоду D достатньої для того, щоб слабкі протон-вуглецеві взаємодії одержали протифазну орієнтацію векторів намагніченості, що необхідна для генерування гетероядерної багатоквантової когерентності. Такі далекі ¹Н-¹³С КССВ мають величину, принаймні на порядок меншу, ніж прямі КССВ через один хімічний зв'язок (звичайно вони менші за 5Гц). D для них повинен становити близько 100 мс (1/2ⁿJ_СН), хоча на практиці часто використовують менші інтервали для запобігання втрати інтенсивності сигналу внаслідок релаксації. Під час тривалого періоду D, гомоядерні розщеплення ¹Н-¹Н, які мають однаковий порядок з гетероядерними КССВ через кілька хімічних зв'язків, також еволюціонують і вносять фазові викривлення в спостережувані кроспіки. Оскільки використовується значно більший інтервал D ніж у послідовності HMQC, такі викривлення настільки малі, що ними можна знехтувати. Для маскування фазових помилок у методі НМВС одержують абсолютні значення сигналів. Для підвищення чутливості період рефокусування D, що використовується в HMQC, тут пропускається, тому гетероядерні взаємодії через кілька хімічних зв'язків знаходяться в протифазі на початку t₂, що перешкоджає використанню декаплінгу на ¹³С. Хоча період D вибирається відповідним до величин далеких КССВ, він може виявитися кратним для КССВ через один зв'язок. Тому часто в спектрі додатково проявляються і такі розщеплення з відносно малою інтенсивністю. Оскільки збір даних здійснюється без розв'язки на протонах, у спектрах може спостерігатися відповідний дублет (це видно на Рис. 6.46). В залежності від точки зору, появу в спектрі таких розщеплень можна вважати пороком, або перевагою, оскільки їх можна використовувати для ідентифікації сигналів протонованих атомів вуглецю. На практиці можна відмовитися від будь-яких схем фільтрації і примиритися з наявністю в спектрі кореляцій через один хімічний зв'язок. Наявність даних розщеплень можна використати для ідентифікації атомів вуглецю, що зв’язані з протонами і взагалі відмовитися від вимірювання спектру HMQC.

Безсумнівно, найбільшою проблемою в методиці НМВС є придушення вихідних сигналів ¹Н-¹²С. Залишки таких сигналів можуть маскувати сателіти сигналів, що пов'язані з далекою ССВ. На відміну від HMQC, у цьому випадку послідовність BIRD не дозволяє повністю видалити небажані сигнали, оскільки одночасно відбувається ослаблення і інформативних сигналів. Традиційно для знищення інтенсивних вихідних сигналів імпульсна послідовність включає тільки фазове циклування. При цьому потрібна винятково висока стабільність роботи спектрометра. Однак, навіть у цьому випадку в спектрі присутні смуги залишкового t₁-шуму, що обмежує застосування методу для рутинних досліджень. Введення в практику досліджень методу імпульсних градієнтів виявилося революційним для методики НМВС, оскільки в цьому випадку вдається повністю позбутися від вихідних сигналів, що в багато разів зменшує величину t₁-шуму. Переваги градієнтного методу селекції сигналів демонструються на спектрах, які наведені на Рис. 6.48. Тут спектр 6.48а записаний в умовах градієнтної селекції сигналів, а спектр 6.48б - за допомогою відповідного фазового циклу за однакових інших умов вимірювання. Спостерігається збільшення сигналів у порівнянні із шумами більше ніж в 256 разів. При записі спектра було використано 4 скани, що відповідає мінімуму, необхідному для роботи фазового циклу (два скани для селекції сигналу і два - для придушення аксіальних піків). В спектрі (а) добре видимі далекі кореляції, а в спектрі (б) вони практично повністю ховаються в шумах. Поліпшити результати у версії фазового циклування вдається шляхом значного збільшення кількості сканів і, відповідно, часу експерименту.

Рис. 6.48.Спектр НМВС, записаний за ідентичних умов але із селекцією сигналу за допомогою (a) імпульсних градієнтів поля і (б) за допомогою фазового циклу.

Використання метода HSQC для виявлення далеких кореляцій виявляється значно менш ефективним. Значна еволюція ¹Н-¹Н розщеплень під час періоду D під дією другого 90^о протонного імпульсу в послідовності INEPT веде до небажаних перенесень намагніченості типа COSY. В методі НМВС з такою проблемою зіштовхуватися не доводиться.