Методы специфического окрашивания.

Основным методом специфического выявления дезоксирибонуклеиновых кислот считается реакция Фельгена. Она основана на кислотном гидролизе нуклеиновой кислоты, при котором от дезоксирибозофосфата отщепляются сначала пурины, затем – пиримидины и в результате освобождаются реакционноспособные альдегидные группы. Оптимальное время гидролиза варьируется в зависимости от объекта изучения и метода фиксации.

Реакция ядерного материала после предварительного гидролиза осуществляется с реактивом Шиффа (фуксинсернистая кислота). Приготовление реактива Шиффа: растворяют 1 г основного фуксина в 100 мл дистиллированной воды, нагретой до кипения, и дают раствору остыть до 60^о. Затем его фильтруют и добавляют 2 г бисульфата или метабисульфата натрия или калия и 20 мл 1н. HCl.

Полученную смесь выдерживают в закрытой посуде в темноте при комнатной температуре 18-24 ч, после чего добавляют 300 мг активированного древесного угля, энергично встряхивая в течение 1 мин, и фильтруют. Полученный раствор должен быть прозрачным светло-желтого цвета. Хранят его в хорошо закрытой посуде, обернутой черной бумагой, в холодильнике. Раствор становится непригодным, когда появляется розовая окраска.

Реакция Фельгена (модификация по Р. Лили). Эта методика дает хорошие результаты для материала, фиксированного в жидкости Карнуа и формалине. Депарафинированные срезы споласкивают в дистиллированной воде, затем помещают в предварительно нагретую до 56-60^о 1 н. HCl и выдерживают при этой температуре 10-15 мин.

Погружают стекла в реактив Шиффа на 10 мин. Стаканчик с реактивом должен быть обернут черной бумагой. Последовательно промывают в трех сменах (1, 2 и 2 мин) сернистой воды. Затем промывают 5 мин в проточной воде, докрашивают в течение нескольких секунд в 0,01% спиртовом растворе прочного зеленого (эту стадию можно опустить), обезвоживают и заключают в канадский бальзам.

Результаты окраски: ядерный хроматин окрашивается в темный пурпурно-красный цвет.

Метиловый-зеленый-пиронин. Этот метод специфически дифференцирует ДНК (зеленый цвет) и РНК (красный цвет).

Лучшие результаты после фиксации в жидкости Карнуа или абсолютном спирте. Состав красителя по Унна: метиловый зеленый - 0,15 г; пиронин - 0,25 г; 96^о-й спирт - 2,5 мл; глицерин - 20 мл; 0,5%-й водный раствор карболовой кислоты - 100 мл. Депарафинированные срезы доводят до воды и окрашивают в течение 20 мин. Промывают охлажденной дистиллированной водой (лучше свежеперегнанной), быстро обезвоживают ацетоном, просветляют смесью ацетон-ксилол (1:1), и через 2 смены ксилола заключают в канадский бальзам.

Результаты окраски: ядра - голубовато-зеленые; ядрышки - красные; цитоплазма – от розового до красного.

Метод Шабадаша (реакция на гликоген). Поскольку гликоген не растворим в крепких спиртах, для его фиксации пользуются спиртовыми растворами. Часто применяют фиксатор Карнуа или спирт-формол.

Метод Шабадаша основан на том, что периодат калия или натрия при воздействии на полисахариды окисляет спиртовые группы, превращая их в альдегидные, которые, реагируя с фуксинсернистой кислотой, дают красно-фиолетовое окрашивание соответствующих включений. Депарафинированные срезы промывают в 2 сменах дистиллированной воды и помещают на 10-15 мин в 0,01 М раствор периодата калия или натрия. Этот раствор следует готовить заранее, учитывая, что периодаты плохо растворяются в воде. Хранят его в темной посуде. Стекла со срезами промывают в 3 сменах дистиллированной воды (по 3 мин) и помещают на 20-25 мин в реактив Шиффа, который также хранится в темной посуде. Затем промывают в 3 сменах сернистой воды (по 3 мин), споласкивают дистиллированной водой, обезвоживают и заключают в канадский бальзам. При необходимости можно докрасить ядра гематоксилином.

2. Рассмотрите микропрепараты (Таблица 5), окрашенные различными красителями. Зарисуйте и подпишите увеличение и тип красителя.

Таблица 5

Препараты тканей, окрашенные разными красителями