Методики исследований.

I. Рутинные исследования.

1. Цитологическое исследование мазков периферической крови и костного мозга проводилось в клинико-диагностической лаборатории ГНЦ РАМН (зав. лабораторией – к.м.н. Л.Ю.Тихонова). Использовались стандартные методы фиксации и окраски.

2. Гистологическое исследование костного мозга (трепанобиопсия) проводилось в патологоанатомическом отделении ГНЦ РАМН (руководитель – член-корр. РАМН, проф. Г.А.Франк). Гистологическое исследование выполнялось на срезах толщиной 3-5 мкм, окрашенных гематоксилин-эозином. Иммуногистохимическое исследование (в.н.с., к.м.н. И.Б.Капланская) выполняли на срезах толщиной 3-5 мкм, помещенных на адгезивные стекла, покрытые L-полилизином. Использовался авидин-биотин-пероксидазный метод с панелью моноклональных и поликлональных антител к: CD21, CD21, CD45RO, CD43, CD3, CD79a, CD5, Cyclin D1, bcl-2, Ki-67, CD25, DBA.44.

II. Специальные исследования.

1. Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили в лаборатории клинической иммунологии (зав. лабораторией – профессор, д.м.н. Т.И.Булычева, в.н.с. лаборатории к.б.н. Р.С.Самойлова). Во всех включенных в анализ случаях определялись общие В-клеточные маркеры CD19, CD20, CD22, клональность В-лимфоцитов по легким цепям Ig каппа (k) и лямбда (λ), специфические для ВКЛ антигены CD103, анти-ВКЛ, CD85, НС2, активационные антигены CD11c, CD25, CD38 и прочие дифференциально-диагностические антигены - FMC7, CD10, CD23, CD5. Лимфоциты крови выделяли центрифугированием в градиенте плотности фекола. Выделенные лимфоидные клетки трижды отмывались холодным 0,9% раствором NaCl с 0,01М фосфатным буфером pH 7,2-7,4 (PBS).

Методика непрямого иммунофлюорисцентного маркирования мембранных антигенов: концентрацию опухолевых клеток в суспензии доводили до 4-5 млн./мл. По 100 мкл суспензии опухолевых клеток в данной концентрации вносили в 96-луночные круглодонные плашки. Клетки осаждали путем центрифугирования 300g – 5 мин. После удаления надосадочной жидкости, согласно выбранной панели антител, в каждую лунку вносили по 20 мкл немеченых мышиных моноклональных антител в заранее отработанном рабочем разведении в PBS с 1% добавкой бычьего сывороточного альбумина (БСА) для блокирования неспецифического связывания антител. В контрольные лунки вместо вместо моноклональных антител вносили 20 мкл среды : 0,01М PBS pH 7,4 – 100мл, БСА – 1г (1%), прогретая эмбриональная телячья сыворотка – 2% (v/v), NaN₃ до 0,1%. Инкубировали 30 мин при t+4^о. Далее, после 2-кратной отмывки холодным PBS, наносили F(ab)₂-фрагменты поликлональных козьих антител против мышиных иммуноглобулинов, коньюгированных с флюоресцин-изотиоцианатом (FITC), в в подобранном рабочем разведении. Инкубировали 30 мин при t+4^о с последующей 3-кратной отмывкой. 8-луночные предметные стекла (Flow, Великобритания) покрывали 15-20мкл раствора L-полилизина 25 мкг/мл на физ. растворе (Sigma, США), для чего их инкубировали во влажной камере в течение 30 мин., перед нанесением клеточной суспензии стекла промывали PBS. После последней отмывки клетки ресуспендировали в 50 мкл PBS, 25 мкл полученной суспензии наносили на предметные стекла. Клетки осаждались на стекле в результате 30-минутной инкубации во влажной камере. Излишки раствора удаляли, клетки заключали в забуференный фосфатным буфером 1:1 глицерин, предметное стекло герметично закрывали покровным. Результаты анализировали путем флюоресцентной и фазово-контрастной микроскопии (микроскоп «Axiophot» фирмы «Opton», Германия). Кроме количественного определения числа позитивных клеток (%) оценивалась степень экспрессии антигенов по интенсивности флюоресценции. Интенсивность свечения нормальных В-лимфоцитов из крови донора принималась за умеренную (+). Соответственно этой точке отсчета отмечалось отсутствие свечения (-), слабое (±) или сильное свечение (++). Использовавшиеся моноклональные антитела приведены в таб.1.

Таблица 1. Панель использованных при иммунофенотипировании моноклональных антител.

2. Тартрат-устойчивую кислую фосфатазу (TRAP) лимфоцитов определяли в лаборатории гемоцитологии (заведующий – профессор, д.м.н. Г.И.Козинец, в.н.с. лаборатории к.б.н. О.А.Дягилева, с.н.с. к.б.н. И.Н.Наумова) на фиксированных мазках лейкоконцентрата или костного мозга, инкубированных в смеси реактивов в течение 2 часов при 37^о.

3. Иммунохимическое исследование белков крови и мочи проводили в лаборатории гуморального иммунитета ГНЦ РАМН (зав. лабораторией к.м.н. Е.Ю.Варламова). Содержание в сыворотке IgA, IgG, IgM, легких цепей каппа и лямбда определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле агарозы. Для выявления секреции моноклонального иммуноглобулина исследовали образцы сыворотки и концентрированной мочи методом электрофореза в геле агарозы и иммунофиксации. Уровень ЦИК определяли методом осаждения в ПЭГ-6000.

По результатам проведенного обследования из 160 включенных больных были сформированы следующие группы:

I. По форме заболевания –

а) с типичной формой ВКЛ - 118 пациентов;

б) с вариантной формой ВКЛ (без лейкопении) - 42 пациента.

II. По возрасту –

больные ВКЛ молодого возраста (≤40 лет) - 41 пациент;

В каждой из выделенных групп больных оценивали клинические особенности течения заболевания, данные лабораторных исследований, эпидемиологические данные по полу и возрасту, по частоте выявления типичного и абберантного иммунофенотипа.

Проведен сравнительный анализ эффективности различных вариантов хирургического (спленэктомия) и консервативного (α-Иф, кладрибин) лечения во всех группах. Охарактеризован спектр и тяжесть осложнений проводимого лечения. Проанализированы редкие случаи заболевания: ВКЛ с секрецией парапротеина, с выраженной лимфаденопатией, с хроническим лимфолейкозом, с Т-клеточной клональностью. Приведены данные о встречаемости вторых опухолей у включенных в исследование больных ВКЛ. Проведен анализ рецидивов заболевания за 12-летний период и результаты их лечения.