Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, англ. – PCR) подразумевает определение нуклеиновых кислот (РНК или ДНК) ВИЧ в биологических жидкостях.

Принцип метода ПЦР-диагностики представлен на рис. 8.

 

Рис. 8. Принцип постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР)

 

При ВИЧ-инфекции используются два варианта ПЦР: качественная и количественная, или вирусная нагрузка (табл.3).

 

Таблица 3 – Характеристики качественной и количественной ПЦР, используемых для диагностики ВИЧ

что определяет материал для исследования клиническое использование
качественная «ДНК-ПЦР»: наличие ДНК ВИЧ, интегрированного в геном клетки-мишени (лимфоцита) – резервуара инфекции культура лимфоцитов крови - определение ВИЧ-статуса в случаях, когда использование для этих целей ИФА/ИБ некорректно  
количественная (вирусная нагрузка) «РНК-ПЦР»: наличие РНК свободных вирионов ВИЧ, находящихся в плазме плазма крови - прогнозирование течения ВИЧ-инфекции у пациентов без терапии; - контроль эффективности АРТ (стартовая VL и в динамике); - выбор тактики ведения ВИЧ-позитивных беременных

 

Качественная ПЦР проводится с целью определения ДНК ВИЧ в лимфоцитах крови для установления ВИЧ-статуса пациента.

Порог чувствительности выявления ДНК ВИЧ методом качественной ПЦР составляет около 5 копий на 106 клеток. Метод тем не менее считается несколько менее точным для диагностики ВИЧ-инфекции, чем ИФА/ИБ, и используется в следующих случаях:

1) когда использование ИФА/ИБ для установления ВИЧ-статуса некорректно:

§ у ВИЧ-экспонированных детей (если у ребенка первых 18 месяцев жизни выявляются антитела к ВИЧ, то неясно чьи они – собственные или материнские);

§ в период «серологического окна» (т.е. когда у инфицированного ВИЧ пациента антитела еще отсутствуют или субопределяемы – см. рис. 4): после профессиональных контактов, при наличии клиники острого ретровирусного синдрома, при тестировании донорской крови (исследование пулированных образцов);

2) для уточнения неопределенных результатов тестирования в ИФА/ИБ.

Для постановки качественной ПЦР с целью установления ВИЧ-статуса ребенка, рожденного ВИЧ-позитивной матерью, не используют пуповинную кровь, так как она может содержать материнскую кровь, а исследуют только кровь ребенка.

Положительный результат ПЦР-определения ДНК ВИЧ в первые 48 часов жизни ребенка позволяет предположить внутриутробное заражение. Вероятность обнаружения ДНК ВИЧ в первые 48 часов жизни ребенка составляет всего 17-38%. Если на первой неделе жизни ПЦР-определение ДНК ВИЧ дает отрицательный результат, а впоследствии – положительный, то считается, что заражение ребенка произошло во время родов. К возрасту 1 месяца ДНК ВИЧ обнаруживается практически у всех инфицированных детей: чувствительность составляет 98%, а специфичность – 99%.

Для постановки диагноза ВИЧ-инфекции ребенку, рожденному ВИЧ-позитивной матерью, обычно проводится двукратное ПЦР-исследование с интервалом 2-3 месяца. Получение отрицательного результата свидетельствует об отсутствии ВИЧ-инфекции, но требует подтверждения путем параллельного получения отрицательного результата в ИФА/ ИБ.

Вирусная нагрузка (ВН, англ. – VL), или количественная ПЦР, проводится с целью определения количества вирусов (РНК ВИЧ) в плазме крови пациента.

Определение вирусной нагрузки имеет значение для:

§ прогноза течения ВИЧ-инфекции (вирусная нагрузка позволяет предсказать скорость снижения количества CD4 лимфоцитов);

§ контроля эффективности проводимой АРТ в динамике (вирусологическая эффективность), вирусная нагрузка – самый важный тест для оценки эффективности терапии;

§ прогноза вероятности передачи ВИЧ (она выше при высокой вирусной нагрузке) как при профессиональных и половых контактах, так и при передаче ВИЧ от матери ребенку, и, соответственно, для выбора схемы медикаментозной постконтактной профилактики и выбора тактики ведения ВИЧ-позитивных беременных;

§ для постановки предварительного диагноза ВИЧ-инфекции пациенту, имеющему симптомы острой ВИЧ-инфекции (диагноз можно предполагать только при обнаружении высокой вирусной нагрузки – выше 100 тысяч копий/мл, и в последующем диагноз следует подтвердить стандартными методами – ИФА/ИБ).

Характеристика используемых для измерения уровня вирусной нагрузки тест-систем представлена в табл. 4.

 

Таблица 4 – Тест-системы для измерения уровня вирусной нагрузки, одобренные FDA [цит. по Дж. Бартлетту, 2006]

Торговое название Amplicor HIV Monitor 1.5 Versant HIV-1 RNA3.0 NucliSens HIV-1 QT
Производитель Roche Bayer bioMerieux
Техника ОТ-ПЦР рДНК NASBA
Сравнение результатов Результаты, получаемые методом ОТ-ПЦР, сравнимы с результатами, получаемыми методом рДНК (Versant) с использованием тест-систем 2.0 и 3.0 Результаты, получаемые методом рДНК, сравнимы с результатами, получаемыми методом ОТ-ПЦР (Amplicor) Результаты, по-видимому, сравнимы с результатами, получаемыми методами ОТ-ПЦР и рДНК, но пока не получе­но достаточно данных
Преимущества / недостатки • Меньше ложноположительных результатов у ВИЧ-отрицательных пациентов по сравнению с тест-системами фирмы Bayer. • Занимает меньше времени. • Хороший динамический диапазон, но выше порог неопределяемой вирусной нагрузки. • Может применяться для обнару­жения вируса в тканях и биологи­ческих жидкостях, например, выделениях половых путей. • Самый большой динамический диапазон.
Динамический диапазон • Стандартный: (Amplicor 1.5) 400-750 000 копий/мл • Суперчувствительный: (Ultra-Direct 1.5) 50-100 000 копий/мл рДНК 3.0: 75-500 000 копий/мл* Количественный тест на ВИЧ-1 NucliSens: 176-3 500 000 копий/мл; динами­ческий диапазон зависит от объема
Подтип вируса Тест-система 1.5: от А до G от А до G от А до G
Необходимый объем материала для исследования • Amplicor: 0,2 мл • Суперчувствительный: 0,5 мл 1 мл От 10 мкл до 2 мл
Пробирки ЭДТА (пробирка с сиреневой крышкой) ЭДТА (пробирка с сиреневой крышкой) ЭДТА, гепарин, цельная кровь, лю­бая биологическая жидкость, МКПК, семенная жидкость, ткани и т. д.
Требования Отделить плазму не позже чем через 6 часов после забора крови, перед транспорти­ровкой заморозить при температуре -20°С или -70°С. Отделить плазму не позже чем через 4 часа после забора крови, перед транспортировкой заморозить при темпера­туре -20°С или -70°С. Отделить сыворотку или плазму не позже чем через 4 часа после забора крови, перед транспорти­ровкой заморозить при температуре -20°С или -70°С.

* нижний порог измерений, установленный FDA, равен 50 копий/мл

Используемые для определения вирусной нагрузки тесты обычно определяют наличие РНК ВИЧ-1 субтипов В или А-G (группа М). Тесты недостаточно точны для выявления ВИЧ-1 групп N или О, а также ВИЧ-2.

Вирусная нагрузка определяется обычно в плазме крови, но некоторыми тестами ее можно определять и в других биологических жидкостях, например, в семенной жидкости, вагинальных выделениях, спинномозговой жидкости, грудном молоке, слюне.

Диапазон определяемых значений вирусной нагрузки различен для разных тест-систем. Минимальный порог определения для используемых в настоящее время в Беларуси тестов составляет 1 500 копий/мл, то есть термин «неопределяемая вирусная нагрузка» не означает отсутствия вируса в крови, а говорит о том, что его количество составляет менее порога определения для данной тест-системы (в нашем случае < 1 500 копий/мл).

Чувствительность теста составляет около 100% при острой ВИЧ-инфекции; специфичность в среднем 97%, но при вирусной нагрузке >10 000 копий/мл приближается к 100%.

Специфичность теста составляет 91-98%, поэтому тест не используется для диагностики ВИЧ-инфекции. Ложноположительные результаты у неинфицированных пациентов регистрируются в 2-9%, обычно показывая низкую концентрацию вируса (<10 000 копий/мл). Диагноз ВИЧ-инфекции, выставленный при обнаружении РНК ВИЧ в крови, должен быть подтвержден стандартными тестами – постановкой качественной ПЦР (определение ДНК ВИЧ) или постановкой ИБ (с повтором ИБ спустя 2-4 месяца после начального сомнительного или отрицательного теста).

Приведенная в табл. 5 градация уровней вирусной нагрузки является в определенной степени условной, но позволяет выделять порог возможного старта прогрессирования ВИЧ-инфекции, при регистрации которого требуется дополнительная оценка клинического статуса и количества CD4 лимфоцитов для решения вопроса о начале АРТ. Вирусная нагрузка в пределах до 5 тысяч копий/мл говорит о низком риске прогрессирования ВИЧ, порог возможного старта прогрессирования составляет > 55 тысяч копий/мл для подростков и взрослых и > 100 тысяч копий/мл (или даже более высокие значения) для детей.

 

Таблица 5 – Условная градация уровней вирусной нагрузки

градация уровней VL, копий/мл (методом RT-PCR)
порог определения < 50 * < 1 500 **
очень низкий уровень 1 500 - 7 тысяч
низкий уровень 7 - 20 тысяч
умеренный уровень 20 - 55 тысяч
порог возможного старта прогрессирования ВИЧ-инфекции > 55 тысяч у подростков и взрослых > 100 тысяч у детей
высокая вирусная нагрузка > 80 - 100 тысяч

* порог определения, достигаемый при использовании некоторых тест-систем и принятый в клинических рекомендациях по оценке эффективности АРТ

** порог определения для используемых в настоящее время в Беларуси тест-систем

 

Вирусная нагрузка у мужчин на фоне сохранного иммунитета может быть несколько выше, чем у женщин (до 2 раз), но при снижении количества CD4 лимфоцитов (<300 клеток/мкл) эти различия исчезают. Поэтому при оценке уровня вирусной нагрузки при принятии лечения о начале АРТ пол пациента не учитывают.

Клиническая трактовка результатов определения вирусной нагрузки сложна, так как:

§ возможны естественные колебания VL в условиях полного благополучия;

§ транзиторное повышение уровня VL могут вызвать появление острого эпизода оппортунистической инфекции или вакцинация;

§ определяемый уровень вирусной нагрузки в крови может не отражать уровень вирусной нагрузки в других тканях (например, в эпителии и выделениях из половых путей, в лимфатических узлах, в ЦНС, в ЖКТ).

Поэтому при трактовке результатов определения вирусной нагрузки следует учитывать следующее:

§ забор крови на VL следует проводить не ранее чем через 2-4 недели после исчезновения симптомов острой инфекции (если невозможно – то все заборы проводить в примерно схожем клиническом состоянии пациента) или вакцинации;

§ исследование крови следует проводить всегда одним и тем же методом в одной и той же лаборатории;

§ значимыми колебаниями VL следует считать колебания более чем в 2-3 раза (поскольку 95%CI для результатов теста составляет 0,3-0,5 lg) – например, повышение с 20 тысяч до более чем 40-60 тысяч копий/мл; при сомнениях, выросла ли VL или осталась на прежнем уровне, следует повторить анализ;

§ результаты определения VL должны заново перепроверяться перед стартом или изменением АРТ.

Существуют особенности вирусной нагрузки у детей:

§ в целом дети имеют более высокие уровни VL, высокой считается VL > 100 тысяч копий/мл;

§ при перинатальной ВИЧ-инфекции: при рождении VL обычно не определяется или низкая (до 10 тысяч копий/мл), ко 2 месяцу жизни достигает высоких значений (более 100 тысяч копий/мл), а затем в течение нескольких лет медленно снижается (в течение первых 2 лет в среднем на 0,6 lg в год, в течение следующих 4-5 лет – на 0,3 lg в год).

На основании уровня вирусной нагрузки нельзя судить о степени повреждения функции иммунной системы и о чувствительности вируса к АРВ препаратам.

 








Дата добавления: 2015-05-30; просмотров: 2554;


Поиск по сайту:

При помощи поиска вы сможете найти нужную вам информацию.

Поделитесь с друзьями:

Если вам перенёс пользу информационный материал, или помог в учебе – поделитесь этим сайтом с друзьями и знакомыми.
helpiks.org - Хелпикс.Орг - 2014-2024 год. Материал сайта представляется для ознакомительного и учебного использования. | Поддержка
Генерация страницы за: 0.009 сек.