Иммуноблотинг

Иммуноблотинг (ИБ, англ. – western blot, WB) подразумевает определение антител к отдельным белкам ВИЧ в биологических жидкостях.

По своей сути метод ИБ схож с ИФА. Отличие состоит в том, что сыворотку пациента добавляют не в лунку с адсорбированным «общим» антигеном ВИЧ, а вносят на панель с отдельными вирусными белками, которые предварительно были электрофоретически «разогнаны» на отдельные фракции сообразно их молекулярной массе. То есть в результате постановки ИБ мы получаем заключение о наличии в образце не общих антител к ВИЧ, а антител к отдельным белкам ВИЧ-1, в том числе к белкам сердцевины вируса (p17, p24, p55), гликопротеинам оболочки (gp41, gp120, gp160) и ферментам (p31, p51, p66).

Принцип метода ИБ представлен на рис. 5.

1. Электрофоретическое разделение белков ВИЧ-1 (стандартный реагент) по их молекулярной массе 2. Инкубация с добавлением исследуемой сыворотки – специфическое соединение белков ВИЧ с соответствующими отдельными антителами к ВИЧ из добавленной сыворотки 3. Инкубация с добавлением меченных ферментом антител к человеческим Ig 4. Детекция окрашенных полос

Рис. 5. Принцип постановки иммуноблотинга (ИБ) [цит. по Э. Фаучи, К. Лэйн, 2003]

Критериями положительного результата ИБ являются:

§ по ВОЗ: сочетание 2 полос, соответствующих gp41 и gp120/gp160;

§ по CDC/APHL: сочетание 2 полос, соответствующих любым 2 из 3 антигенов ВИЧ – p24, gp41, gp120/gp160.

Критерием отрицательного ИБ является отсутствие полос.

Критерием неопределенного ИБ является наличие любых полос, сочетание которых не удовлетворяет критериям положительного результата.

Трактовку результатов ИБ осуществляет врач-лаборант, который выдает клиницисту заключение «ИБ положительный» или «ИБ отрицательный». Примеры интерпретации результатов ИБ приведены на рис. 6.

1. Положительный ИБ к ВИЧ-1 2. Отрицательный ИБ (у здорового человека, иммунизированного белками внешней оболочки ВИЧ-1) 3. Сомнительный ИБ (у инфицированного ВИЧ-2) 4. Сомнительный ИБ (наличие антител, перекрестно реагирующих с p24 Ag) 5. Отрицательный ИБ

Рис. 6. Трактовка результатов иммуноблотинга (ИБ) [цит. по Э. Фаучи, К. Лэйн, 2003]

Тесты для ИБ более дороги, чем для ИФА, но обладают значительно более высокой специфичностью. Поэтому ИБ не применяется для скрининга, а является подтверждающим тестом при получении положительного результата в ИФА. При проведении обследования пациента, от момента заражения которого прошло >3 месяцев, по стандартной методике с двукратным тестированием в ИФА и подтверждением в ИБ чувствительность составляет 99,5% (95%CI 98-99,9%), а специфичность – 99,994%.

Ложноотрицательные результаты определения антител к ВИЧ в ИФА/ИБ у некоторых пациентов (около 0,3% в популяциях с высокой распространенностью ВИЧ-инфекции и <0,001% в популяциях с низкой распространенностью) обусловлены возможностью затягивания периода «серологического окна» до 6 месяцев, появления серореверсии на поздних стадиях ВИЧ-инфекции или у длительно получающих АРТ пациентов, идиопатической «атипичной иммунной реакцией», агаммаглобулинемией, инфицированием штаммом ВИЧ-2 или ВИЧ-1 О- или N- групп, а также возможностью технической или канцелярской ошибки.

Ложноположительные результаты определения антител к ВИЧ в ИФА/ИБ являются казуистикой (частота встречаемости 0,0004-0,0007%) и могут быть обусловлены появлением аутоантител, обнаружением поствакцинальных антител (у пациентов, участвующих в клинических испытаниях вакцин против ВИЧ), а также возможностью технической или канцелярской ошибки. Ложноположительный результат можно заподозрить, если у пациента отсутствуют факторы риска инфицирования ВИЧ, не определяется вирусная нагрузка и показатели количества CD4 лимфоцитов в пределах нормы. В этом случае серологическое обследование следует провести повторно.

Кроме всего прочего, пациенты могут сообщать врачу ложные сведения о якобы отрицательных результатах теста на ВИЧ (что наблюдается достаточно часто при фиксировании пациента на «стадии отрицания» нормальной реакции принятия диагноза) или о якобы положительных результатах теста (пациенты с синдромом Мюнхгаузена).

Неопределенные результаты ИБ получают достаточно часто – в 4-20% случаев. Неопределенный результат ИБ может быть обусловлен обследованием во время сероконверсии (обычно первыми появляются антитела к р24, затем – другие) или на поздних стадиях ВИЧ-инфекции (когда обычно исчезают антитела к белкам сердцевины), при наличии перекрестно реагирующих неспецифических антител (при коллагенозах, васкулитах, других аутоиммунных заболеваниях, лимфомах, заболеваниях печени, инъекционном потреблении наркотиков, рассеянном склерозе, во время беременности и после недавней иммунизации), при инфицировании штаммом ВИЧ-2 или ВИЧ-1 О- или N- групп, при обнаружении поствакцинальных антител (у пациентов, участвующих в клинических испытаниях вакцин против ВИЧ), а также возможностью технической или канцелярской ошибки.

При получении неопределенного результата ИБ рекомендуется оценить риск инфицирования ВИЧ у данного пациента, провести повторное серологическое тестирование (у не имеющих риска инфицирования пациентов – через 3 месяца, у имеющих риск инфицирования пациентов – через 1, 2 и 6 месяцев) и предложить пациенту принимать меры по профилактике передачи вируса вплоть до подтверждения его отсутствия. В спорных случаях возможно тестирование на наличие ДНК ВИЧ в качественной ПЦР (см. ниже).