СУЩНОСТЬ, ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ МАРКЕТИНГА 4 страница

ный набор ферментов и для весьма небольшого числа болезней (гепатиты,

инфаркт миокарда, органические поражения почек, поджелудочной железы,

печени и др.). Так, уровень липазы, амилазы, трипсина и химотрипсина

в крови резко увеличен при сахарном диабете, злокачественных поражениях

поджелудочной железы, болезнях печени и др. Резко повышается в сы-

воротке крови уровень двух аминотрансфераз, креатинкиназы (и ее изо-

форм) и лактатдегидрогеназы (и ее изоформ) при инфаркте миокарда;

умеренно повышено их содержание при поражениях тканей мозга и печени.

Определяют, кроме того, активность кислой фосфатазы (уровень повышен

при карциноме предстательной железы), щелочной фосфатазы, холинэсте-

разы и некоторых других органоспецифических ферментов (например,

гистидазы, уроканиназы, глицинамидинотрансферазы) в сыворотке крови

при патологии костной ткани, печени, метастатических карциномах и т. д.

Доказано, что органы и ткани человека характеризуются специфическим

ферментным и изоферментным спектром, подверженным не только инди-

видуальным, но и суточным колебаниям. Существует большой градиент

концентрации ферментов между внутриклеточными и внеклеточными час-

тями тела. Поэтому любые, даже незначительные, повреждения клеток

(иногда функциональные расстройства) приводят к выделению ферментов

во внеклеточное пространство, откуда они поступают в кровь. Механизм

гиперферментации (повышенное содержание ферментов в крови) до конца

не расшифрован. Повышение уровня внутриклеточных ферментов в плазме

крови прямо зависит от природы повреждающего воздействия, времени

действия и степени повреждения биомембран клеток и субклеточных струк-

тур органов. В оценке ферментных тестов для диагностических целей особое

значение имеет знание периода полужизни (полураспада) в плазме крови

каждого из диагностических ферментов, что делает важным выбор точного

времени для ферментного анализа крови. Весьма существенным является

также знание особенностей распределения (топографии) ферментов в инди-

видуальных органах и тканях, а также их внутриклеточной локализации.

В последнее время стали применять ферменты рестрикции – специфи-

ческие эндонуклеазы (см. главу 13), катализирующие разрывы межнуклео-

тидных связей ДНК, для диагностики фенилкетонурии, α- и β-талассемии

и других наследственных болезней человека. Метод основан на поли-

морфизме рестрикционных фрагментов ДНК.

Из представленных данных следует, что диагностическая энзимология

может служить основой не только для постановки правильного и своевре-

менного диагноза болезни, но и для проверки эффективности применяемого

метода лечения.

Дальнейшее развитие диагностической энзимологии преимущественно

идет по двум перспективным направлениям медицинской энзимологии: по

пути упрощения и рациональной модификации уже испытанных методов

и по пути поиска новых органоспецифических (тканеспецифических) фер-

ментов и изоферментов.

Третье направление медицинской энзимологии – энзимотерапия, т.е.

использование ферментов и модуляторов (активаторов и ингибиторов)

действия ферментов в качестве лекарственных средств, имеет пока не-

большую историю. До сих пор работы в этом направлении почти не

выходят за рамки эксперимента. Исключение составляют некоторые про-

теиназы: пепсин, трипсин, химотрипсин и их смеси (абомин, химопсин),

которые применяют для лечения ряда болезней пищеварительного тракта.

Помимо протеиназ, ряд других ферментов, в частности РНКаза, ДНКаза,

гиалуронидаза, коллагеназы, эластазы, отдельно или в смеси с протеина-

зами используются при ожогах, для обработки ран, воспалительных очагов,

устранения отеков, гематом, келоидных рубцов, кавернозных процессов при

туберкулезе легких и др. Ферменты применяются также для лечения

сердечно-сосудистых заболеваний, растворения сгустков крови. В нашей

стране разработан первый в мире препарат иммобилизованной стрептокина-

зы, рекомендованный для лечения инфаркта миокарда. Калликреины – фер-

менты кининовой системы используются для снижения кровяного давления.

Важной и многообещающей областью энзимотерапии является при-

менение ингибиторов ферментов. Так, естественные ингибиторы протеиназ

(α1-трипсин, α1-химотрипсин, α-макроглобулин) нашли применение в тера-

пии острых панкреатитов, артритов, аллергических заболеваний, при ко-

торых отмечается активация протеолиза и фибринолиза, сопровождаю-

щаяся образованием вазоактивных кининов.

В последнее время получило признание применение в онкологической

клинике ферментов бактериальной природы в качестве лекарственных

средств. Широко используется L-аспарагиназа (выпускается в промышлен-

ных количествах и L-глутамин(аспарагин)аза для лечения острых и хрони-

ческих форм лейкозов и лимфогранулематозов. Более десятка описанных

в литературе бактериальных ферментов испытаны в основном на животных

с перевивными опухолями или на раковых клетках опухолей человека

и животных, выращенных в культуре ткани. Основными постулатами

применения ферментов в онкологии являются различия в метаболизме

клеток опухолей по сравнению с обменом в нормальной, здоровой, клетке.

В частности, современные стратегия и тактика энзимотерапии опухолевых

поражений учитывают разную чувствительность нормальных и опухолевых

клеток к недостатку (дефициту) незаменимых (так называемых эссенциаль-

ных) факторов роста. К таким ростстимулирующим факторам относятся не

только пищевые факторы (витамины, незаменимые аминокислоты, макро-

и микроэлементы), но и ряд так называемых заменимых веществ, включая

заменимые аминокислоты, к недостатку которых опухолевая клетка ока-

зывается в силу особенностей ее обмена более чувствительной, чем нор-

мальная. Лечебный эффект, например, L-аспарагиназы и L-глутамин(аспа-

рагин)азы при лейкозах, вероятнее всего, объясняется необратимым распа-

дом как глутамина, так и аспарагина. Оказалось, что опухолевые клетки

для своего роста и размножения нуждаются в аминокислотах из организма,

поскольку сами лишены способности синтезировать амиды аминокислот,

в то время как нормальные клетки наделены этой способностью. Был

сделан вывод о том, что амидный азот глутамина и аспарагина выполняет

в клетках ряд уникальных функций, которые лучше выяснены для глута-

мина (см. главу 12). В частности, амидный азот глутамина оказался

абсолютно необходимым и не заменимым другими аминокислотами источ-

ником атома азота минимум в 10 реакциях синтеза, например, пуриновых

и пиримидиновых нуклеотидов, соответственно ДНК и РНК, АТФ, ге-

ксозаминов, гистидина и др. Таким образом, не лишена основания гипо-

теза, что любой фермент или агент, катализирующий необратимое рас-

щепление незаменимого для опухолевой клетки пищевого фактора (вклю-

чая аминокислоты), может в принципе быть применен в энзимотерапии

опухолей, если будут устранены ограничения, связанные с белковой при-

родой фермента. В оценке эффективности ферментов в экспериментальной

и клинической онкологии имеется немало противоречий и очень много

пробелов. Положительные результаты, отмеченные в ряде случаев, вселяют

надежду, что приготовление стандартных ферментных препаратов (включая

создание иммобилизованных форм) в промышленных масштабах и их

разумное применение в клинике, организованное на строгой научной

основе, несомненно дадут в руки врачей еще одно ценное оружие в борьбе

с опухолевыми заболеваниями человека.

Идея применения ферментов в качестве лекарственных средств (фарма-

кологии ферментов) всегда казалась заманчивой. Однако их нестабиль-

ность, короткий период полураспада, нежелательные антигенные свойства,

связанные с белковой природой ферментов и опасностью развития аллер-

гических реакций, трудности доставки к пораженным органам и тканям

(мишеням) существенно ограничивали возможности использования фер-

ментных препаратов. В разработке методов иммобилизации ферментов (см.

ранее) наметились конкретные пути преодоления указанных трудностей:

применение водорастворимых, биосовместимых носителей, например по-

лимолочной кислоты (легко разлагается в организме), использование ме-

тодов химической модификации и микрокапсулирования, приготовление

моно- и поликлональных антител и ферментсодержащих липосом и т.д.

В последнее время интенсивно разрабатываются методы направленного

транспорта ферментов, заключенных в своеобразные микроконтейнеры

(тени эритроцитов, липосомы и др.), к внешней поверхности которых могут

быть прикреплены адресные (векторные) белковые молекулы (например,

иммуноглобулины – антитела против специфических компонентов органа

или ткани-мишени, в частности опухоли). Иммобилизованные ферменты

в качестве лекарственных средств начали применять в специальных колон-

ках для экстракорпоральной перфузии крови (типа искусственной почки).

Такое лечение полностью исключает нежелательные воздействия на орга-

низм чужеродного белка и может проводиться длительное время.

Таким образом, области применения ферментов в медицине действи-

тельно безграничны. Рассмотренные примеры ясно показывают, какие

замечательные и многообещающие перспективы уже сегодня открывает

перед будущими врачами медицинская энзимология.

38) Биохимический анализ крови - Маркеры повреждения печени и поджелудочной железы

Определение активности ферментов наиболее широко используется при диагностике как первичных врожденных ферментопатий, так и вторичных, т. е. развивающихся в результате патологических нарушений на клеточном и субклеточном уровнях.

Изменение активности одних и тех же ферментов может наблюдаться при самых различных заболеваниях и, следовательно, не является специфичным для какой-либо патологии.

В связи с этим определение активности ферментов имеет диагностическую значимость только при сопоставлении с изменениями других показателей и клинической картиной заболевания в целом.

Чаще всего для определения активности ферментов в клинико-диагностических лабораториях используют плазму.

Ферменты, выявляемые в плазме, условно делятся на 3 группы:

- собственные ферменты плазмы, выполняющие свои функции только в сосудистом русле (ферменты свертывания крови, холинэстераза, церулоплазмин);

- экскреторные ферменты, попавшие в плазму из секретов (дуоденального сока, слюны);

- клеточные ферменты, попавшие в плазму из поврежденного органа.

Появление, степень, длительность сдвига ферментативной активности ферментов в плазме или сыворотке крови обусловлены несколькими причинами: размерами и степенью повреждения клеток, величиной молекул фермента, его внутриклеточной локализацией, прочностью связей со структурными элементами клеток, влиянием разных факторов на активность и скорость деградации фермента в клетках.

Каждый орган в организме имеет определенный спектр ферментов. Его характеристикой может быть более или менее типичная группа ферментов, типичная энзиматическая констелляция. Это позволяет с помощью определения группы органоспецифических ферментов получать сведения о функциях отдельных органов организма.

Обычно ферментодиагностика — это определение ряда ферментов. Моноорганоспецифических ферментов практически не существует.

Измеряемая в сыворотке крови активность ферментов — результат совместной и согласованной работы клеточных структур (процессов синтеза и распада ферментов), функции мембран, скорости инактивации. Кроме того, на активность ферментов в крови значительное влияние оказывает продолжительность жизнедеятельности. Для основного числа ферментов период полураспада составляет от 10 до 120 часов. При этом ферменты с коротким периодом полураспада лучше отражают процессы, протекающие в органе.

39 Энзимодиагностика

Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека. Принципы энзимодиагностики основаны на следующих позициях:

при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутриклеточных ферментов повреждённых клеток;

количество высвобождаемого фермента достаточно для его обнаружения;

активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно длительного времени И отличается от нормальных значений;

ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определённых органах (органоспецифичность);

существуют различия во внутриклеточной локализации ряда ферментов.

1. Причины, приводящие к увеличению количества

ферментов в крови

Ферменты плазмы крови можно разделить на 2 группы. Первая, относительно небольшая группа ферментов активно секретируется в плазму крови определёнными органами. Например, печень синтезирует неактивные предшественники ферментов свёртывающей системы крови. Ко второй относят большую группу ферментов, высвобождающихся из клеток во время их нормального функционирования. Обычно эти ферменты выполняют свою функцию внутри клетки и не имеют физиологического значения в плазме крови. У здорового человека активность этих ферментов в плазме низкая и достаточно постоянная, так как постоянно соотношение скоростей высвобождения их из клеток и скоростей разрушения.

При многих заболеваниях происходит повреждение клеток, и их содержимое, в том числе и ферменты, высвобождаются в кровь. К причинам, вызывающим высвобождение внутриклеточного содержимого в кровь, относят нарушение проницаемости мембраны клеток (при воспалительных процессах) или нарушение целостности клеток (при некрозе). Определение в крови активности ряда ферментов хорошо налажено в биохимических лабораториях, что используют для диагностики заболеваний сердца, печени, скелетной мускулатуры и других тканей. Уровень активности ферментов в плазме коррелирует со степенью повреждения клеток.

Для энзимодиагностики имеют большое значение знания о субклеточной локализации ферментов. Так, появление в плазме крови ферментов, имеющих только цитозольную локализацию, свидетельствует о воспалительном процессе; при обнаружении митохондриальных или ядерных ферментов можно говорить о более глубоких повреждениях клетки, например о некрозе.

Однако повышение концентрации ферментов не всегда связано с повреждением тканей. При избыточной клеточной пролиферации, например при онкопролиферативных процессах, при повышенной скорости синтеза некоторых ферментов в клетках или при нарушенном клиренсе (способности вьпюдиться почками) наблюдают повышение концентрации в крови определённых ферментов. Врачам следует учитывать, что нормальные значения активности ферментов в крови детей и беременных женщин отличаются от показателей, характерных для взрослых здоровых людей.

2. Изоферменты

Ферменты, катализирующие одну и ту же химическую реакцию, но отличающиеся по первичной структуре белка, называют изофермен-тами, или изоэнзимами. Они катализируют один и тот же тип реакции с принципиально одинаковым механизмом, но отличаются друг от друга кинетическими параметрами, условиями активации, особенностями связи апофермента и кофермента.

Природа появления изоферментов разнообразна, но чаще всего обусловлена различиями в структуре генов, кодирующих эти изоферменты. Следовательно, изоферменты различаются по первичной структуре белковой молекулы и, соответственно, по физико-химическим свойствам. На различиях в физико-химических свойствах основаны методы определения изоферментов.

По своей структуре изоферменты в основном являются олигомерными белками. Причём та или иная ткань преимущественно синтезирует определённые виды протомеров. В результате определённой комбинации этих протомеров формируются ферменты с различной структурой - изомерные формы. Обнаружение определённых изоферментных форм ферментов позволяет использовать их для диагностики заболеваний.

Изоформы лактатдегидрогеназы. Фермент лак-татдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует обратимую реакцию окисления лактата (молочной кислоты) до пирувата (пировиноградной кислоты).

Лактатдегидрогеназа - олигомерный белок с молекулярной массой 134 000 Д, состоящий из 4 субъединиц 2 типов: М (от англ, muscle - мышца) и Н (от англ, heart - сердце). Комбинация этих субъединиц лежит в основе формирования 5 изоформ лактатдегидрогеназы (рис. 2-35, А). ЛДГ1 и ЛДГ2 наиболее активны в сердечной мышце и почках, ЛДГ4 и ЛДГ5 - в скелетных мышцах и печени. В остальных тканях имеются различные формы этого фермента.

Изоформы ЛДГ отличаются электрофоретической подвижностью, что позволяет устанавливать тканевую принадлежность изоформ ЛДГ (рис. 2-35, Б).

Появление в эволюции различных изоформ ЛДГ обусловлено особенностями окислительного метаболизма тканей. Изоферменты ЛДГ4 и ЛДГ5 (М-типы ЛДГ) работают эффективно в анаэробных условиях, ЛДГ, и ЛДГ2 (Н-типы) - в аэробных, когда пируват быстро окисляется до СО2 и Н2О, а не восстанавливается до молочной кислоты.

При ряде заболеваний исследуют активность ЛДГ в плазме крови. В норме активность ЛДГ составляет 170-520 ЕД/л. Повышение активности наблюдают при острых поражениях сердца, печени, почек, а также при мегалобластных и гемолитических анемиях. Однако это указывает на повреждение лишь одной из перечисленных тканей.

Для постановки диагноза необходимо исследование изоформ ЛДГ в плазме крови методом электрофореза. На рис. 2-35, В представлены электрофореграммы плазмы крови здорового человека, больного инфарктом миокарда и больного гепатитом. Выявление в плазме крови тканеспецифичес-ких изоформ ЛДГ используют в качестве диагностического теста повреждения данной ткани.

40) ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Определение количественного содержания ферментов в биологических объектах представляет известные трудности, поскольку, за редким исключением, ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости катализируемой реакции в определенных, согласованных условиях измерения. При оптимальных условиях температуры, рН среды и полном насыщении фермента субстратом скорость катализируемой реакции пропорциональна концентрации фермента. О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции. Для выражения концентрации фермента и количественной оценки его активности в условных единицах Комиссией по ферментам Международного биохимического союза была рекомендована стандартная международная единица (Е или U): за единицу активности любого фермента принимается то количество его, которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1 микромоля субстрата или образование 1 микромоля продукта в минуту (мкмоль/мин).

В связи с введением Международной системы единиц (СИ) предложено новое выражение активности фермента в каталах (кат, kat): 1 кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 молю в 1 с (1 моль/с). Отношение международной единицы (U) к каталу можно выразить следующим образом: 1 кат = 1 моль•с–1 = 60 моль•мин–1 = 60•106 мкмоль•мин–1 = 6•107 U, или: 1 U = 1 мкмоль•мин–1 = (1/60) мкмоль•с–1 = (1/60) мккат = 16,67 нкат. Таким образом, 1 U фермента соответствует 16,67 нкат.

Рекомендовано, кроме того, измерять активность фермента при температуре 25°С, оптимуме рН и концентрации субстрата, превышающей концентрацию насыщения. В этих случаях скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субстрата и будет зависеть только от концентрации фермента.

Для выражения активности в практической работе с ферментами часто пользуются произвольными понятиями удельной и молярной активности. Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка). Количество молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в продукт в процессе реакции в единицу времени при полном насыщении фермента субстратом, принято называть числом оборотов фермента, или молярной активностью (молярная каталитическая активность выражается в каталах на 1 г-моль фермента). Одна молекула каталазы эритроцитов способна, например, расщепить в 1 с 44000 молекул перекиси водорода.

41).ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ

Иммобилизованными ферментами называются ферменты, ис­кусственно связанные с нерастворимым носителем, но сохраня­ющие свои каталитические свойства.

Еще в 1916 г. Дж. Нельсон и Е. Гриффин показали, что сахароза, сорбированная на угле, сохраняла свою каталитическую активность, но лишь в 1953 г. Н. Грубхофер и Д. Шлейт впервые осуществили ковалентные связывания амилазы, пепсина, РНКазы и карбоксипептидазы с нерастворимым носителем.

В 1971 г. на первой конференции по инженерной энзимологии был узаконен термин «иммобилизованные ферменты». Однако в понятие «иммобилизация» в настоящее время вкладывают более широкий смысл, чем связывание на нерастворимом носителе, а именно - полное или частичное ограничение свободы движения белковых молекул.

Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ в сравнении со свободными молекулами. Прежде всего, такие фер­менты, представляя собой гетерогенные катализаторы, легко отделяются от реакционной среды, могут использоваться многократно и обеспечивают непрерывность каталитического процесса. Кроме того, иммобилизация ведет к изменению свойств фермента: субстратной специфичности, устойчивости, зависимости активности от параметров среды. Иммобилизованные ферменты долговечны и в тысячи и десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов. Так, происходящая при температуре 65 °С термоинактивация лактатдегидрогеназы, иммобилизованной в 60 %-м полиакриламидном геле, замедлена в 3600 раз по сравнению с нативным ферментом. Все перечисленное обеспечивает высокую экономичность, эффектив-ность и конкурентоспособность технологий, использующих иммобилизованные ферменты.

^ 5.1.1.Носители для иммобилизации ферментов

По Дж. Порату (1974), идеальные материалы, используемые для иммобилизации ферментов, должны обладать следующими основными свойствами: нерастворимостью; высокой химической и биологической стойкостью; значительной гидрофильностью; достаточной проницаемостью, как для ферментов, так и для коферментов, субстратов и продуктов реакции; способностью носителя легко активироваться (переходить в реакционно-способную форму).

Естественно, ни один из используемых в настоящее время в качестве носителя материал не отвечает полностью перечисленным требованиям. Тем не менее, существует широкий набор носителей, пригодных для иммобилизации определенных энзимов в конкретных условиях.

В зависимости от природы носители делятся на органические и неоргани-ческие материалы.

^ Органические полимерные носители. Иммобилизация многих ферментов осуществляется на полимерных носителях органической природы. Существующие органические полимерные носители можно разделить на два класса: природные и синтетические полимерные носители. В свою очередь, каждый из классов органических полимерных носителей подразделяется на группы в зависимости от их строения. Среди природных полимеров выделяют белковые, полисахаридные и липидные носители, а среди синтетических- полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные.

К преимуществам природных носителей следует отнести их доступность, полифункциональность и гидрофильность, а к недостаткам - биодеградируемость и достаточно высокую стоимость.

Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто используют целлюлозу, декстран, агарозу (агар) и их производные. Для придания химической устойчивости линейные цепи целлюлозы и декстрана поперечно сшивают эпихлоргидрином. В полученные сетчатые структуры довольно легко вводят различные ионогенные группировки. Химической модификацией крахмала сшивающими агентами (формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид) синтезирован новый носитель - губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью к гликозидазам.

Из природных аминосахаридов в качестве носителей для иммобилизации применяют хитин, который в значительных количествах накапливается в виде отходов в процессе промышленной переработки крабов и креветок. Хитин химически стоек и имеет хорошо выраженную пористую структуру.

Среди белков практическое применение в качестве носителей нашли структурные протеины, такие, как кератин, фиброин, коллаген и продукт переработки коллагена - желатина. Эти белки широко распространены в природе, поэтому доступны в значительных количествах, дешевы и имеют большое число функциональных групп для связывания фермента. Белки способны к биодеградации, что очень важно при конструировании иммобилизованных ферментов для медицинских целей. К недостаткам белков как носителей в этом случае следует отнести их высокую иммуногенность.

^ Синтетические полимерные носители. Благодаря разнообразию и доступности материалы этой группы широко используются как носители для иммобилизации. К ним относятся полимеры на основе стирола, акриловой кислоты, поливинилового спирта; полиамидные и полиуретановые полимеры. Большинство синтетических полимерных носителей обладают механической прочностью, а при образовании обеспечивают возможность варьирования в широких пределах величины пор, введения различных функциональных групп. Некоторые синтетические полимеры могут быть произведены в различных физических формах (трубы, волокна, гранулы). Все эти свойства полезны для разных способов иммобилизации ферментов.

^ Носители неорганической природы. В качестве носителей наиболее часто применяют материалы из стекла, глины, керамики, графитовой сажи, силикагеля, а также силохромы, оксиды металлов. Их можно подвергать химической модификации, для чего носители покрывают пленкой оксидов алюминия, титана, гафния, циркония или обрабатывают органическими полимерами. Основное преимущество неорганических носителей - легкость регенерации. Подобно синтетическим полимерам неорганическим носителям можно придать любую форму и получать их с любой степенью пористости.

Таким образом, к настоящему времени создано огромное число разнообразных носителей для иммобилизации ферментов. Однако для каждого индивидуального фермента, используемого в конкретном технологическом процессе, необходимо подбирать оптимальные варианты, как носителя, так и условий и способов иммобилизации.

^ 5.1.2.Методы иммобилизации ферментов

Существуют два принципиально различных метода иммобилизации фер-ментов: без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации) и с образованием ковалентной связи между ними (химические методы иммобилизации). Каждый из этих методов осуществляется разными способами.

^ Физические методы иммобилизации ферментов реализуются посредст-вом адсорбции фермента на нерастворимом носителе, путем включения энзимов в поры поперечносшитого геля, в полупроницаемые структуры или двухфазные системы.

Адсорбция ферментов на нерастворимых носителях. При адсорбционной иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхности носителя за счет электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных связей. Адсорбция была первым методом иммобилизации ферментов (Дж. Нель-сон, Э.Гриффин, 1916), но и сейчас не потеряла своего значения и стала наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментов в промышленности. В литературе описано получение адсорбционным способом более 70 иммобилизованных ферментов с использованием главным образом таких носителей, как кремнезем, активированный уголь, графитовая сажа, различные глины, пористое стекло, полисахариды, синтетические полимеры, оксиды алюминия, титана и других металлов. Последние применяются наиболее часто. Эффективность адсорбции молекулы белка на носителе определяется удельной поверхностью (плотностью центров сорбции) и пористостью носителя. Процесс адсорбции ферментов на нерастворимых носителях отличается крайней простотой и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем (статистическим способом, при перемешивании, динамическим способом с использованием колонок). С этой целью раствор фермента смешивают со свежим осадком, например, гидроксида титана, и высушивают в мягких условиях. Активность фермента при таком варианте иммобилизации сохраняется практически на 100 %, а удельная концентрация белка достигает 64 мг на 1 г носителя.

К недостаткам адсорбционного метода следует отнести невысокую прочность связывания фермента с носителем. При изменении условий иммобили-зации могут происходить десорбция фермента, его потеря и загрязнение продуктов реакции. Существенно повысить прочность связывания фермента с носителем может предварительная его модификация (обработка ионами металлов, полифункциональными агентами - полимерами, белками, гидрофобными соединениями, монослоем липида и пр.). Иногда, наоборот, модификации подвергается молекула исходного фермента, однако зачастую это ведет к снижению его активности.