Серологічні методи діагностики

3.8.1. Імуноферментний і радіоімунний аналізи (ІФА і РІА)

ІФА і РІА – імунологічні реакції між антигеном і гомологічними антитілами, які відносяться до твердофазних імуносорбентних методів дослідження.

ІФА і РІА проводяться у ряд послідовних етапів:

- перший відомий компонент реакції (це можуть бути антитіла або антиген) сорбують на тверду фазу (лунки полістиролових планшетів);

- досліджувані проби (з антигенами або, відповідно, антитілами) вносять в рідкому, розчиненому вигляді та інкубують;

- відмивають тверду фазу від незв’язавшихся неспецифічних антитіл (антигенів), на ній залишається тільки прореагувавший комплекс антиген-анитіло;

На кінцевому етапі в ІФА і РІА використовують антитіла (антигени), мічені ферментом (в ІФА) або радіонуклідом, звичайно ¹²⁵І (у РІА).

У багатьох тест-системах, наприклад, ІФА-ВІЛ ½-О, ІФА-анті-ДЕЛЬТА М, ІФА-АНТІ-HEV та інших до зв’язаного комплексу “антиген-антитіло” вносять імуноферментний кон’югат, мічений пероксидазою хрону. Окрім пероксидази хрону в різних тест-системах ІФА використовують і інші природні ферменти – лужну фосфатазу, b-лактазу, каталазу тощо.

Після наступного відмивання незв’язаного кон’югата до лунок планшету додають забарвлюючий субстрат пероксидази – ортофенілендіамін..

У ІФА результати визначають шляхом візуального або інструментального визначення інтенсивності забарвлення компонентів реакції (за допомогою рідера або спектрофотометра), а у РІА – за рівнем радіоактивності (за допомогою g-лічильників).

У ІФА використовують субстрати, що під дією ферменту переходять у забарвлену розчинну (1) або нерозчинну (2) форму.

До групи 1 належать ортофенілендіамін, парааміносаліцилова кислота, хлоронафтол, р-нітрофенілфосфат та інші. До групи 2 відносяться бензидин, діамінобензидин.

Технологія одержання тест-систем ІФА і РІА має основними етапами

- одержання вірусного антигена;

- одержання гіперімуної сироватки та противірусних антитіл, мічених ферментом, або I¹²⁵.

Одержання вірусних антигенів грунтується на застосуванні традиційних (культивування вірусів) і нетрадиційних (біотехнологія та хімічний синтез) методів. Природні антигени застосовують у вигляді нерозведених віріонних препаратів, окремих структурних білків вірусів, клітин тканин, інфікованих вірусом, або лізатів інфікованих клітин. Працюючи з вірусами, що погано або зовсім не культивуються, використовують біологічний матеріал від хворих або померлих від вірусної інфекції людей та тварин. НВ-антиген одержують із плазми носіїв віруса гепатиту А, кишкові віруси – з калу хворих, вірус гепатиту D (дельта-агент) – з печінки людей, які померли від дельта-гепатиту, і з печінки експериментально інфікованих бабаків. Синтетичні антигени – у вигляді пептидів, одержаних шляхом мікробіологічного або хімічного синтезу. Так, під час серологічної діагностики ВІЛ-інфекції (СНІДу) в ІФА, крім природного антигену, одержуваного за допомогою культивування ВІЛ у культурах Т-лімфоцитів, використовують хімічно синтезований пептид пептоскрин.

У набір для імуноферментного аналізу вірусу імунодефіциту людини – “ІФА-ВІЛ ½-0” входить суміш рекомбінантних поліпептидів – аналогів поліпептидів ВІЛ-1 та ВІЛ-2 (Env ВІЛ-1, Gag ВІЛ-2, Env-ВІЛ-3), синтезованих у бактеріях кишкової палички (Eschеrichia coli). Ці пептиди повністю біологічно безпечні, але присутність у тест-системі деяких біологічних компонентів (сироваток , плазми крови) та хімічних речовин потребує реалізації правил безпеки:

- робота повинна проводитись у спеціально обладнаному приміщенні;

- необхідно працювати у гумових рукавичках;

- розчини не піпетувати ротом;

- усі рідкі відходи обробляти 4% розчином хлораміну або 6% розчином перекису водню на протязі 3 годин;

- усі тверді відходи збирати в спеціальний контейнер і потім автоклавувати 1 годину при 120^оС;

- інструменти, прилади та поверхня, на яких проводився аналіз, необхідно до та після роботи протирати 70%-вим етанолом.

- Вірусні антигени, які використовуються в ІФА і РІА як стандартні антигени (тобто позитивний контроль антигену) мають відповідати певним вимогам. Сорбований на твердій фазі антиген має бути очищеним. Очищення вірусу проводять за допомогою методів ультрацентрифугування, хроматографії та ультрафільтрації.

Концентрація вірусного антигену становить 10 – 20 мкг/мл. Коли працюють з особливо небезпечними вірусами (Ласса, ВІЛ та ін.), використовують неінфекційні препарати, інактивовані формаліном, дією УФ-опромінення, детергентів тощо.

Джерелом одержання противірусних імуноглобулинів для конструювання імуносорбентних тест-систем є поліклональні імуносорбентні сироватки або асцитичні рідини, моноспецифічні сироватки (проти окремих структурних білків вірусу), моноклональні антитіла (антитіла певного класу проти конкретної антигенної детермінанти вірусу). Використовують також жовтки яєць імунізованих курей, сироватки крові реконвалесцентів (у разі вірусного гепатиту А) та носіїв (у разі ВІЛ-інфекції). Імуноглобуліни використовують в концентрації 2 – 10 мкг/мл.

До переваг твердофазних імуносорбентних методів належить висока чутливість і специфічність, швидкість, точність і відтворюваність, можливість стандартизації одержаних даних, дослідження мікрооб’ємів, відносна простота системи реєстрації результатів.

Дещо нижча чутливість ІФА (у 5 – 10 разів) порівняно з РІА зумовлена меншою чутливістю методів виявлення забарвлених молекул, ніж визначення радіоактивності.

Чутливість тест-систем визначають шляхом титрування антигену (референс-препарату) з відомою концентрацією з білком (або вірусними частками), що становить 1 – 5 нг. Під чутливістю розуміють також кількість (%) позитивних результатів під час дослідження стандартного набору (комплекту) імунних сироваток, у яких містяться (за даними більш чутливого методу) противірусні антитіла.

Специфічність визначають як кількість (%) негативних результатів під час дослідження стандартного набору (комплекту) імунних сироваток, що не мають противірусних антитіл. Крім того, специфічність можна розуміти як можливість тонкої імунологічної диференціації вірусних антигенів і антитіл до них.

Висока специфічність імуносорбентних тестів визначається характеристикою антитіл, використовуваних для конструювання детекторних тест-систем, і проявляється у можливості диференціації вірусних антигенів на групо-, підгрупо-, типо-, підтипо- та штамоспецифічні, а також у виявленні антигенних варіантів вірусу навіть у межах одного штаму.

Твердофазні імуносорбентні методи використовують для експрес-діагностики, виявлення вірусного антигена у досліджуваних пробах або противірусних антитіл класу М у сироватці крові хворого в гострий період інфекції.

Ретроспективну серологічну діагностику використовують за умови роботи з кількома вірусними інфекціями (грип, парагрипозні, аденовірусні, ентеровірусні та інші інфекції). Грунтується вона на виявленні збільшення титру противірусних антитіл у 4 рази і більше під час дослідження парних сироваток крові; при вірусних гепатитах A, B, C, D, E, ВІЛ-інфекції та деяких інших.

3.8.2. Метод флуоресцюючих антитіл (МФА)

Імунофлюоресценція – специфічне світіння в культурах клітин, інфікованих вірусами, що виникає під дією ультрафіолетового опромінення, у разі обробки сироватками, міченими флюорохромами.

МФА застосовують для виявлення вірусних антигенів у патологічному матеріалі (мазки з носової частини глотки, з біоптатів, мазки-відбитки з трупного матеріалу, інфіковані культури клітин), а також антитіла в сироватках крові осіб, які перехворіли на вірусну інфекцію.

Під час дослідження у люмінесцентному мікроскопі (у ультрафіолетовому спектрі) утворений специфічний комплекс антиген-антитіло виявляється за світінням.

МФА грунтується на взаємодії антигену з відповідним антитілом, міченим флуоресцюючими барвниками. Серед багатьох запропонованих флуорохромів в практиці найширше використовують ФІТЦ (флуоресцеїнізотіоціанат), що зумовлює люмінесценцію зеленого кольору, і родамін, який дає люмінесценцію червоного кольору.

МФА дає змогу проводити експрес-діагностику більшості вірусних інфекцій: натуральної віспи, сказу, простого герпесу, вітряної віспи й оперезуючого лишаю, ротавірусних гастроентеритів, грипу, парагрипу, аденовірусної, респіраторно-синцитіальної, ріно- та арбовірусної інфекції, кору, поліомієліту, інших ентеровірусних інфекцій, червоної висипки, СНІДу та ін.

На препарат з фіксованими інфікованими клітинами наносять на 30 хв. специфічну люмінсціюючу сироватку (кон’югат), потім надлишок її зливають, препарат промивають і досліджують у люмінесцентному мікроскопі.

Метод МФА застосовують у трьох основних модифікаціях: прямого, непрямого методів і методу антикомплементарної імунофлуоресценції.

За допомогою прямого МФА виявляють вірусні антигени у інфікованих клітинах.

Метод непрямого МФА складається з двох етапів. На першому відбувається взаємодія антигена з неміченим антитілом. На другому – немічене специфічне антитіло зв’язується з антивидовим міченим антитілом. Антивидові антитіла одержують шляхом імунізації одного виду тварин сироваткою іншого виду тварин або людини. Потім антивидові імуноглобуліни мітять ФІТЦ.

За допомогою непрямого методу можна виявляти як вірусні антигени на інфікованих клітинах, так і антитіла (зокрема IgM) у сироватках крові хворих і осіб, які перехворіли на вірусну інфекцію.

3.8.3. Реакція зв’язування комплементу (РЗК)

Класична реакція зв’язування комплементу вперше була описана у 1901 році Борде та Жангу. РЗК відноситься до непрямих двосистемних гетерологічних 5-компонентних реакцій. У ній беруть участь дві системи АГ-АТ (специфічна, дослідна – антиген + антитіло і індикаторна, гемолітична - еритроцити барана + гемолізин) та комплемент. Комплемент – це складова частина білкової природи свіжих сироваток людини та тварин. У більшій кількості комплемент утримується у свіжих сироватках морських свинок.

РЗК ґрунтується на тому, що при взаємодії в дослідній системі АГ та АТ утворюється специфічний комплекс АГ+АТ, який адсорбує (зв’язує) комплемент. За відсутності специфічної спорідненості між АГ та АТ утворення комплексу не відбувається і комплемент залишається вільним. Проте, процес взаємодії комплементу з дослідною системою є невід’ємним, тому на другому етапі до реакції вводять другу, завідомо специфічну індикаторну гемосистему, яка свідчить про результати РЗК. Якщо у першій системі зв’язування комплементу відбувається (позитивний результат), в індикаторній відзначається відсутність (затримка) гемолізу. Якщо адсорбція комплементу у дослідній системі не відбувається (негативний результат), в індикаторній системі з’являється гемоліз.

РЗК використовується у двох напрямках:

для визначення у сироватках специфічних антитіл при наявності відомих антигенів;

для визначення природи невідомих антигенів за допомогою імунних сироваток, утримуючих специфічні антитіла.

У вірусології РЗК виявляють антигени вірусів і антитіла для ранньої і ретроспективної (після захворювання) діагностики вірусних інфекцій. Також РЗК отримала широке визнання при вивченні розмноження вірусів у організмі тварин, у курячих ембріонах, у культурі тканин. При цьому важливо використовувати парні сироватки, які були взяті у перші дні захворювання і між другим та третім тижнями.

Оскільки вірусні антигени часто утримують, крім вірусу, інші речовини, що здатні зв’язувати комплемент, контролем для них служать антигени з нормальних тканин чи рідин і сироватки нормальних тварин для визначення їх здатності фіксувати на себе комплемент, тобто їх антикомплементарності.

3.8.4. Реакція нейтралізації (РН)

Реакція нейтралізації широко використовується в вірусології: за її допомогою можна виявити нарощування антитіл у сироватці крові людей, що перехворіли, чи імунних організмів, можна ідентифікувати віруси і визначати їх антигенну структуру.

У РН встановлюється здатність імунної сироватки (антитіл) пригнічувати інфекційні властивості вірусу, тобто його здатність до розмноження у чутливих тканинах. Звичайно РН високоспецифічна, тому що імунна сироватка нейтралізує тільки гомологічні штами вірусу. Однак, у сироватках здорових людей і тварин присутні неспецифічні інгібітори, тому доцільно говорити не про віруснейтралізуючі антитіла, а про віруснейтралізуючу активність сироватки, яка у ряді випадків може бути неспецифічною. Тому при постановці РН необхідно ставити відповідні контролі (перевіряти віруснейтралізуючу активність сироватки до імунізації чи у перші дні захворювання, щоб мати можливість правильно оцінювати результати реакції).

Наявність віруснейтралізуючої активності сироваток людей і експериментальних тварин можна виявити у дослідах на тваринах, на курячих ембріонах і в культурі тканини хоріоналантоїсної оболонки курячого ембріону, якщо вони чутливі до досліджуваного вірусу.

У реакції нейтралізації беруть участь 2 компоненти: вірус та сироватка. РН може бути поставлена у двох варіантах: 1) з’єднують рівні об’ємні кількості одного і того же розведення (чи нерозведеної) сироватки зі зростаючими дозами вірусу; чи 2) з’єднують рівні обсяги різних розведень сироватки з постійною дозою вірусу.

Вірус для РН необхідно попередньо відтитрувати, щоб визначити його граничну біологічну активність. Особливо важливо встановити титр вірусу у випадку, коли у реакції використовуються різні розведення сироватки и постійна доза вірусу. Часто при цьому використовують дозу вірусу, рівну 100 чи 1000 LD₅₀.

Віруснейтралізуючі антитіла накопичуються у період одужання (реконвалесценції), але зберігаються тривалий час. Оптимальні терміни для визначення антитіл у кожному випадку різні і залежать від особливостей імунітету при тій чи іншій інфекції. Наприклад, при грипі кількість віруснейтралізуючих антитіл значно наростає до 3-4 тижня і знижується до 6 місяців; при весняному-літньому енцефаліті вони з’являються тільки через 1,5-2 місяці.

Для отримання достовірних діагностичних даних необхідно досліджувати кратні сироватки, що були взяті у гострому періоді і в період одужання. Сироватки можна зберігати у герметично закритому стерильному посуді при 4 ⁰С.

3.9. Реакція гемаглютинації (РГА) та реакція гальмування гемаглютинації (РГГА)

Гемаглютинація – це феномен склеювання еритроцитів унаслідок дії на них різних біологічних агентів, зокрема й вірусів. Гемаглютинуючі властивості виявлені у багатьох вірусів, патогенних для людини. Ці віруси належати до родів Оrthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Pоxviridae, Reoviridae, Adenoviridae та ін (табл. 14).

Таблиця 14