Для виділення вірусів

Культура клітин – найбільш економічно вигідна жива система, що замінює курячі ембріони та організми чутливих тварин. Простота культивування, швидкість відтворення результатів, наочність змін, що виникають внаслідок репродукції вірусів, вігідно відрізняють цю систему від інших. Проте існують деякі віруси, що важко адаптуються до культури клітин. Також не виключено існування феномену персистенції у них інших вірусів.

В наш час термін “культура клітин” став загальним поняттям, що включяє у себе також органні культури, в яких маленькі фрагменти тканин або цілі ембріональні органи експландуються зі збереженням тканинної архітектури, та культуру клітин, коли тканини діспергуються механічно, ферментативно, або шляхом спонтанної міграції клітин з експлантату клітини розмножуються у вигляді суспензії або моношару адсорбованих на субстраті клітин.

Підбираючи той чи інший тип органної чи клітинної культури слід принимати до уваги, що органна культура на протязі довгого часу підтримує гістологічне та біохімічне діференціювання і після початкової травми, завданої експлантацією, стає, як правило, не здатною до розмноження на протязі декількох діб і навіть тижнів. Кількісні дослідження органних культур ускладнюються навіть невеликою різницею в геометрії та складі експлантантів.

Культури клітин, напроти, не мають, як правило, структурної організації, втрачають характерну гістотипову архітектуру та пов’язані з нею біохімічні ознаки. Клітини в культурі розмножуються, що забезпечує одержання великої маси клітин та їх розподіл на ідентичні паралелі. Отримана клітинна популяція може бути збережена шляхом заморожування.

Як правило, культури, одержані з ембріональних тканин, краще виживають та більш активно ростуть, в порівнянні з культурами з відповідних дорослих тканин. Дорослі тканини мають, як правило, знижену проліферативну ативність (здатність до поділу), та більш високий вміст клітин спеціалізованих, асоційованих з неклітинним матриксом. Ембріональні тканини мають багато практичних переваг перед дорослими і широко використовуються в вірусологічній практиці.

Слід брати до уваги, підбираючи клітинну культуру для роботи, що нормальні тканини, на відміну від тканин пухлинних, мають обмежений час життя. Клітинні культури, отримані з пухлинних тканин, здатні до поділу практично без обмежень у часі. Нормальні клітини ростуть як недиференційовані стволові клітини, або клітини-попередники. І наступне диференціювання в такій культурі супроводжується часто повним припиненням клітинної проліферації.

Клітинні культури, щойно виділені з тканини, носять назву первинних культур. Ця назва за ними зберігається до початку субкультивування (пересіву на свіже живильне середовище). Клітини первинної культури звичайно гетерогенні і характеризуються невисокою здатністю до поділу, але в них найбільш повно представлені типи клітин тієї тканини, звідки вони були одержані. Субкультивування забезпечує можливість продовжити життя культури, отримати лінії клітин, проводити клонування. При цьому в багатьох випадках субкультивування призводить до втрати у спеціалізованих клітин ознак диференціації.

Після декількох пересівів лінія клітин або гине, або “трансформується” і стає постійною клітинною лінією. Різниця властивостей первинних і трансформованих клітин та великий період часу (іноді декілька місяців) перед появою “переживаючих” клітин дає змогу припустити мутаційну природу їх появи. Неможливо виключити також і наявність в популяції первинних клітин так званих “безсмертних” клітин, особливо в культурах, одержаних з пухлин.

Поява постійної лінії клітин констатується за морфологічними змінами (зменшення розміру клітин, зниження їх здатності до закріплення на субстраті – адгезивності,округлення та збільшення ядерно-цитоплазматичного відношення), по скороченню часу, потрібного на поділ (з 36 – 48 до 12 – 36 годин), по зниженню залежності від сироватки, по збільшенню гетероплоїдності.

Таким чином, до переваг постійних ліній клітин відноситься їх більша швидкість росту, можливість виходу більшої біомаси, можливість розмножуватись у простіших середовищах, здатність до росту в суспензії. До недоліків цих ліній відноситься хромосомна нестабільність, відхилення від фенотипу донора та втрата специфічних тканевих маркерів.

3.6. Індикація вірусів у живих системах

В організмі чутливих тварин виникають клінічні симптоми захворювання, відставання в розвитку та загибель новонароджених. В уражених вірусом органах з’являються характерні гістологічні зміни, наприклад, включення. У процесі репродукції вірусів у живих системах виникають зміни, що дають змогу виявити вірус, визначити якісно і кількісно його інфекційну активність.Для окремих представників кожної родинив вірусів характерні свої специфічні зміни (Коксакі А та Коксакі В).

У курячого ембріона під час розмноження вірусів візуально визначають потовщення оболонок ембріона, судинного малюнку, гіперемію, крововиливи, а також появу специфічних утворень у вигляді віспин, бляшок тощо. Наслідком репродукції вірусу є затримка розвитку або загибель курячого ембріона

Індикацію вірусу в культурі клітин здійснюють за цілою низкою специфічних і неспецифічних змін, що виникають у процесі їх репродукції.

До специфічних змін у культурах клітин належать:

1. Цитопатична дія (ЦПД) – її визначають, як комплекс морфологічних змін у процесі взаємодії віруса з клітиною.

2. Включення, які розглядають як: а) очаги репродукції вірусу у клітині; б) накопичення вірусних часток або молекул їхніх білків; в) реакцію клітин на присутність у них вірусу.

Включення поділяють, залежно від розташування, на ядерні (віруси герпесу, аденовіруси, поліомавіруси, флавівіруси та ін.), цитоплазматичні (віруси віспи, грипу, сказу тощо) та змішані. Залежно від чутливості до барвника виділяють базофільні й ацидофільні включення.

3. Бляшкоутворення – здатність вірусів у присутності поживного покриття різного складу до локального розмноження у клітинній культурі з наступним руйнуванням сусідніх клітин і формуванням у клітинному моношарі дефектів – вірусних бляшок. Їх також групують за розмірами, формою, ступінню прозорості, чисельністю.

Кожна бляшка формується як результат розмноження однієї вирусної частки, та відповідає одній бляшкотворній одиниці (БТО) інфекційної активності вірусу.

У культурах клітин відбуваються такі неспецифічні зміни: проникність плазматичної мембрани, сегментування, локалізація хроматину в ядрі, хромосомні аберації (структурні зміни хромосом), зморщування або пікноз ядра, вакуолізація цитоплазми тощо.

У деяких випадках неспецифічні зміни можуть переходити у специфічні, наприклад, вакуолізуючий вірус SV-40 спричиняє утворення вакуолей у цитоплазмі клітин. Реєстрування таких змін дає підставу стверджувати про наявність або відсутність вірусу в культурі клітин. Належність вірусу до певного типу можна встановити лише за допомогою серологічних реакцій.

Суперінфікування – поява цитопатичних змін у культурі клітин під впливом іншого вірусу. Інтерференція передбачає пригнічення цитопатичної дії одного вірусу під впливом іншого або під дією інтерферонів.