Этапы секвенирования.

1. Проведение ПЦР. Позволяет получить множественные копии небольших фрагментов ДНК размером от 300 до 1000 нуклеотидов. Секвенирование больших фрагментов затруднено, так как при проведении их электрофореза невозможно выявить фрагменты, отличающиеся в один нуклеотид.

2. Очистка амплифицированных фрагментов ДНК. Проводят очистку ампликонов от шлаков – остатков ПЦР реакции (праймеров, несвязавшихся нуклеотидов).

3. Секвенирование. Проводят ряд последовательных стадий (рис. 38):

а) приготовление реакционной смеси, которая содержит:

- изучаемую ДНК,

- праймер,

- ДНК-полимеразу и буфер для неё,

- дезоксинуклеотидтрифосфаты (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ),

- меченые флюоресцентной меткой дидезоксинуклеотиды, которые обрывают синтез цепочки ДНК, так как лишены 3'-OH группы, необходимой для образования мостика между двумя нуклеотидами;

б) проведение реакции ПЦР-секвенирования;


Рис. 38.Этапы секвенирования

1. С помощью ПЦР получают множественные копии изучаемого гена, размер которых не должен превышать 1000 п. о. Образуемые в ПЦР ампликоны выявляют электрофорезом. 2. Ампликоны очищают от ПЦР-шлаков (праймеров, нуклеотидов).


       
 
3а, б. С помощью флуоресцентно меченых терминаторов синтеза ДНК-цепи, получают множество фрагментов ДНК, синтез которых оборван на аденине, тимине, гуанине, цитозине. Количество получаемых фрагментов ДНК равно сумме А, Т, Г, Ц, присутствующих в секвенируемом фрагменте.   3в. Проводят электрофорез в денатурирующем полиакриламидном геле, в котором разделяются фрагменты ДНК, отличающиеся в один нуклеотид.
 
А Ц Г Т А Ц Г Т 1 1 1 1 2 2 2 2 Образец 1 Образец 2









Дата добавления: 2015-02-23; просмотров: 1394; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ


Поиск по сайту:

При помощи поиска вы сможете найти нужную вам информацию, введите в поисковое поле ключевые слова и изучайте нужную вам информацию.

Поделитесь с друзьями:

Если вам понравился данный ресурс вы можете рассказать о нем друзьям. Сделать это можно через соц. кнопки выше.
helpiks.org - Хелпикс.Орг - 2014-2019 год. Материал сайта представляется для ознакомительного и учебного использования. | Поддержка
Генерация страницы за: 0.004 сек.