Материал и методы микробиологической диагностики заболеваний, вызываемых хеликобактером.

Забор и транспортировка материала. Биоптат рекомендуется брать из мест с максимально выраженной гиперемией и отеком, желательно как из тела, так и из антрального отдела желудка до начала антибиотикотерапии.

Для успешного культивирования НР, чтобы продлить срок транспортировки биоптата из эндоскопического кабинета в микробиологическую лабораторию до суток необходимо поместить его транспортную среду (Стюарта, Кэри-Блера, Бью Мерьо).

1) Бактериологический метод – культивирование НР, используя биоптаты СОЖ, с обязательной постановкой антибиотикограммы, т. к. НР резистентен ко многим антибиотикам.

2) Гистологический метод – исследование гистологических препаратов СОЖ, окрашенных по Граму, Гимзе, и др. Оценка проводтся количественно:

- < 20 бактериальных клеток в поле зрения – слабая степень обсемененности;

- 20-50 – средняя;

- > 50 – высокая.

3) Цитологическая диагностика – выявление НР в мазках-отпечатках.

4) Биохимические – постановка уреазного теста с биоптатом, оксидазного и каталазного тестов. Уреазный тест. В диагностические среды, включающие мочевину и индикатор, помещают гастробиоптат. Если в среде начинает накапливаться аммоний (продукт гидролиза мочевины уреазой), рН среды меняется в щелочную сторону, и индикатор меняет цвет.

5) ИФА – определение антител к НР в крови больного.

6) ПЦР – полимеразная цепная реакция дает возможность идентифицировать видоспецифичный для HP фрагмент ДНК. Материалом для него являются биоптаты СОЖ, желудочный сок, смывы с поверхности ротовой полости, зубной налет, копрофильтраты.

Особенности диагностики для определения эффективности антихеликобактерной терапии.Контрольное исследование проводят спустя 4-6 недель после курса лечения или окончания лечения антибиотиками или антисекреторными средствами. Диагностика осуществляется не менее чем двумя методами. Для методов непосредственного обнаружения (бактериологический, морфологический, уреазный) необходимо исследование минимум 2 биоптатов из тела желудка и 1 биоптата из антрального отдела.

Профилактика, основы патогенетической терапии заболеваний, вызываемых хеликобактером.Специфическая профилактика не разработана. Важным является соблюдение санитарно-гигиенических правил в быту, организация централизованного водоснабжения в населенных пунктах, санитарно-просветительная работа среди населения, жесткое соблюдение режима стерилизации и дезинфекции в ЛПУ, особенно в кабинетах фиброгастроскопии с целью предупреждения ятрогенного заражения больного и профессионального заражения врача.

Основу патогенетической терапии хеликобактерной инфекции составляет рациональная антибиотикотерапия в сочетании антисекреторными препаратами и другой симптоматической терапией.

5.3. Самостоятельная работа по теме:

1. Проведите бактериологическое исследование по обнаружению и выделению предполагаемого возбудителя из испражнений, взятых у больных с подозрением на холеру.

1 этап: Учтите и оцените результаты РИФ с материалом отобследуемого и холерной люминесцирующей сывороткой. Сделайте вывод.

Холера относится к особо опасным инфекциям, поэтому работа должна выполняться только специально подготовленным персоналом при тщательном соблюдении всех правил работы с возбудителями ООИ.

Испражнения забирают из предварительно тщательно отмытого от дезраствора судна или с помощью ректальной петли. Наилучшей транспортной средой является 1% пептонная вода с рН 8,2-8,6. Материал необходимо доставить в лабораторию не позднее 2-х часов.

Экспресс-методом является РИФ с люминесцирующей холерной сывороткой и исследуемым материалом (демонстрационный препарат). Техника выполнения: приготовленный препарат на стекле помещают в чашку Петри, заливают люминесцирующей сывороткой, кладут комочек мокрой ваты, закрывают крышкой и инкубируют в термостате при 37^оС 30 мин. После инкубирования препарат отмывают, высушивают и микроскопируют в люминесцентном микроскопе. При положительной реакции на темном фоне видны светящиеся изогнутые палочки – ориентировочно холерные вибрионы.

Исследуемый материал засевают в 1% пептонную воду (так называемая 1-ая пептонная вода) и на чашки со щелочным агаром; инкубируют в термостате при 37^оС – чашки в течение 10-12 часов, пробирки с пептонной водой – 4-6 часов.

Через указанное время пептонная вода мутнеет, на поверхности её образуется нежная серовато-голубоватая плёнка, состоящая из бактерий, легко разрушающаяся при встряхивании. Плёнку специальной изогнутой петлёй диаметром 7-10 мм пересевают на вторую пептонную воду; одновременно проводят высев на чашки со щелочным агаром.

2 этап: Изучите и оцените результаты посева испражнений на щелочной агар. Дайте характеристику выросшим колониям.

Приготовьте фиксированный препарат из характерной изолированной колонии, окрасьте по Граму и промикроскопируйте.

Приготовьте нативный препарат «раздавленная капля» и промикроскопируйте в фазово-контрастном микроскопе.

Поставьте и учтите реакцию иммобилизации с частью отобранной колонии и О1-холерной сывороткой.

Поставьте и учтите РА на стекле с О1-холерной сывороткой (1:50) и частью характерной колонии.

Полученные результаты занесите в протокол и сделайте вывод.

Холерные вибрионы образуют на плотной питательной среде нежные, прозрачные, округлые, выпуклые колонии (S-форма) диаметром 2-3 мм, серовато-голубоватые в проходящем свете. В мазках, окрашенных по Граму, холерные вибрионы имеют вид изогнутых грамотрицательных палочек. Они активно подвижны в нативном препарате и агглютинируются О1-холерной сывороткой (1:50).

Типичные колонии пересевают на косяк со щелочным агаром и на комбинированную среду с лактозой и сахарозой, инкубируют в термостате при 37^оС 10-12 часов.

На 3 этапе для определения вида выделенной культуры ставят развёрнутую РА с О1-холерной сывороткой, проводят посев культуры на «пёстрый ряд» (сахароза, арабиноза, манноза) и OF-тест (среда Хью-Лейфсона); для выявления биовара проводят посев культуры на среду с полимиксином В, ставят реакцию фаголизиса с фагами «С» и эльтор, проводят тест на гемолиз эритроцитов. Для определения серовара ставят развёрнутую РА с типовыми сыворотками Инаба и Огава.

Вибрионы, вызывающие холеру, на комбинированной среде ферментируют сахарозу и не разлагают лактозу, а в «пестром ряду» ферментируют сахарозу и маннозу, но не ферментируют арабинозу (1-я группа Хейберга); агглютинируются холерной О-сывороткой.

Вибрионы биовара eltor гемолизируют эритроциты барана, лизируются фагом «эльтор» и не чувствительны к полимиксину В. Вибрионы классического биовара не гемолизируют эритроциты барана, лизируются фагом «С» и чувствительны к полимиксину В.

На 4 этапе учитывают результаты исследований, начатых на 3 этапе идентификации выделенной культуры.

Учтите и оцените результаты:

- посева чистой культуры на «пёстрый ряд»и на среду с полимиксином В;

- реакции гемолиза эритроцитов;

- реакции фаголизиса с фагами «С» и «эльтор»;

- развёрнутых РА с О-холерной сывороткой и типовыми сыворотками Огава, Инаба.

На основании полученных результатов идентифицируйте культуру, укажите вид, биовар и серовар. Заполните бланк-направление и бланк-ответ из бак.лаборатории.

2. Ознакомьтесь и опишите в протоколе биопрепрараты: холерная агглютинирующая О-сыворотка, типовые агглютинирующие сыворотки Огава и Инаба, люминесцирующая холерная сыворотка, холерные фаги – классический «С» и эльтор, холерная вакцина, холероген-анатоксин, указав при этом, что они содержат, для чего и как применяются.