Критерии оценки увеличения проницаемости цитоплазматической мембраны
Уменьшение электрического сопротивления ткани.Мет одом оценки проницаемости мембран для ионов может служить изменение электрического сопротивления (импеданса) ткани. Последний включает в себя омическую и емкостную составляющие, поскольку каждая клетка представляет собой как бы систему конденсаторов (биологические мембраны) и резисторов (биологические мембраны, межклеточная жидкость и цитоплазма). При повреждении клеток наблюдается уменьшение омического сопротивления тканей, связанное в основном с возрастанием ионной проницаемости клеточных мембран.
Окраска цитоплазмы различными красителями. Вод ораствори-мые красители плохо проникают через мембраны неповрежденных клеток и потому слабо прокрашивают внутриклеточные структуры. Увеличение проницаемости цитоплазматических и внутриклеточных мембран при повреждении клетки приводит к возрастанию количества красителя, вошедшего в клетку и внутриклеточные структуры. На этом основаны многие гисто (цито)-химические методы определения жизнеспособности клеток.
Снижение мембранного потенциала покоя. Разность электрических потенциалов между содержимым клетки и окружающей средой (мембранный потенциал покоя) создается, как известно, в основном диффузией ионов калия из клетки в окружающую среду. Неравномерное распределение ионов между клеткой и окружающей средой, лежащее в основе генерации электрических потенциалов на мембране, обеспечивается постоянной работой молекулярных ионных насосов (Na+-K+- АТФа-
Часть I. ОБЩАЯ НОЗОЛОГИЯ
Ранние изменения в функционировании внутриклеточных структур при повреждении
Таблица
Изменение | Проявление |
Увеличение проницаемости цитоплазматической мембраны | Увеличение электропроводности ткани Увеличение связывания красителей Изменение мембранного потенциала Выход ионов калия из клетки Выход метаболитов Увеличение обьема (набухание) клеток Увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция |
Нарушение структуры и функций митохондрий | Снижение потребления кислорода Увеличение проницаемости внутренней митохондриальнои мембраны Набухание митохондрий Снижение кальцийаккумулирующей способности |
Ацидоз | Активация Ма*/Н+-обмена. Повышение внутриклеточной концентрации ионов натрия Набухание клеток |
Повреждение эндоплазма-тического ретикулума | Выход Са2+ в цитоплазму, нарушение системы синтеза белка |
Изменение активности ферментов и рецепторов | Активация ферментов лизосом Активация эндонуклеаз - апоптоз |
Повреждение генетического аппарата клетки | Повреждение рибосом |
зы и Ca2f - Mg2* -АТФазы), встроенных в мембраны клеток. Так, внутри клеток содержание Са2т примерно в 10000 раз ниже, чем в окружающей среде; в клетках гораздо больше К4 и меньше Na*, чем в плазме крови или межклеточной жидкости (табл. 9). Благодаря различию в концентрации ионов в клетке и окружающей среде на цитоплазматической мембране имеется разность потенциалов со знаком «минус» внутри клетки (около 70 мВ для нервных и мышечных клеток). Уменьшение мембранного потенциала покоя при действии повреждающих факторов происходит как в результате неспецифического увеличения ионной проницаемости, так и при уменьшении градиентов концентрации ионов ■следствие выключения работы ионных насосов; последнее происходит как при прямом повреждении Na+-K*-AT<Pa3bi, так и при снижении уровня АТФ вследствие нарушения биоэнергетических процессов в митохондриях. Например, установлено снижение мембранного потенциала покоя клеток печени у лабораторных животных при асфиксии. Снижение мембранного потенциал наблюдается также при ХОЛОДОВОМ, радиационном, аллергическом и других повреждениях клеток, лизосом и прочих субклеточных структур.
Выход ионов калия из клеток. При активно работающей Ка+-К+-АТФазе на цитоплазматической мембране поддерживается разность потенциалов со знаком «минус» внутри клетки, под действием которой ионы калия входят в клетку. Этот постоянный поток К* внутрь клетки компенсирует спонтанный выход калия наружу, который происходит в силу диффузии этих катионов из области с более высокой концентрацией калия в область с более низкой его концентрацией. Повреждение клетки сопровождается снижением содержания в ней АТФ, падением электрического потенциала на цитоплазматической мембране, повышением содержания внутриклеточного Са2' и выходом калия из клеток. Освобождение калия из клеток описано при механической травме, различных интоксикациях, аллергических состояниях, гипоксии и многих других повреждениях органов и тканей. Понижение содержания ионов калия в клетке может происходить также под влиянием больших доз минералокортикоидных гормонов, при действии некоторых лекарственных веществ, например сердечных гликозидов. В свою очередь, увеличение концентрации калия во внеклеточной среде приводит к снижению мембранного потенциала соседних клеток, что в слу-
Глава 3 / МЕСТНЫЕ И ОБЩИЕ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА ПОВРЕЖДЕНИЕ
Распределение ионов калия и натрия и снаружи некоторых клеток
Таблица 9
Клетки | Концентрация, М | Отношение внутриклеточной | |||||
Внутри Снаружи | концентрации к наружной | ||||||
калий | натрий | калий | натрий | калий | натрий | ||
Эритроциты человека | 22:1 | 1:3,88 | |||||
Одиночное волокно портняжной мышцы лягушки | 2,6 | 48:1 | 1:7 | ||||
Гигантский аксон кальмара | 19:1 | 1:10 |
чае электровозбудимых тканей может вызвать генерацию потенциалов действия. Так, увеличение концентрации калия в очаге инфаркта миокарда может стать одной из причин возникновения фибрилляции сердца.
Накопление ионов кальция в цитоплазме. В нормальных клетках концентрация ионов кальция в цитоплазме характеризуется исключительно низкими значениями: 10 7 или даже 108 М, тогда как в окружающей клетку среде содержится 103 М ионов кальция. При этом следует иметь в виду, что ионы кальция проходят в клетку не только самопроизвольно (процесс «утечки» через мембрану), но и (в некоторых клетках) через кальциевые каналы в мембране. Эти каналы могут открываться в ответ на изменение мембранного потенциала, присоединение гормонов и медиаторов к мембранным рецепторам. Компенсирует вход ионов Са2+ в клетку работа трех типов кальцийтранс-портирующих систем: кальциевый насос (Са2*-Mg3'-AT<Pa3a) в мембранах саркоплазматического ретикулума и клеточной мембране, система аккумуляции Ca2f в митохондриях, и в некоторых клетках, Ма+/Са2+-обменник, встроенный в ци-топлазматическую мембрану.
При повреждении клетки нарушается работа митохондрий: снижается мембранный потенциал и прекращается окислительное фосфорили-рование. При снижении мембранного потенциала в митохондриях уменьшается поглощение этими структурами Са2+. Снижение уровня АТФ в клетке приводит к выключению работы Са21-!У^2'-АТФазы цитоплазматической и мембран саркоплазматического ретикулума. Все это способствует накоплению кальция в цитоплазме. Увеличение концентрации Na' в клетке вследствие угнетения натриевого насоса при недостатке АТФ приводит к выключению и NaVCa2*-o6-мена через клеточную мембрану. В результате
всего этого происходит увеличение концентрации кальция от 10 8-10 7М (в норме) до 10 б-10 5 М. Это приводит к активации большого числа кальцийзависимых ферментов (протеин-киназ, фосфолипаз, фосфодиэстеразы циклических нуклеатидов и др.), нарушениям в цитоске-лете, активации сократительных структур, образованию нерастворимых включений кальция в матриксе митохондрий, повреждению внутриклеточных мембран и общей дезорганизации метаболизма. Морфологически это проявляется в замедлении броуновского движения различных включений внутри клетки (увеличение «вязкости протоплазмы») и возрастании светорассеяния; красители начинают легче проникать в клетку и связываются в большом количестве с внутриклеточными структурами - все эти признаки типичны для «неспецифической реакции клетки на повреждение» по Насонову и Александрову (см. выше).
Выход метаболитов. Увеличение проницаемости мембраны клеток и ухудшение работы ионных насосов приводит к тому, что компоненты цитоплазмы выходят в окружающую среду. Вышедшие из клеток вещества отнюдь не безразличны для других клеток, тканей и органов. Так, среди веществ, выходящих из клеток, поврежденных в результате ишемии (нарушения кровотока) или ожога, имеются полипептиды, обладающие способностью вызвать остановку сердца (ишемический, ожоговый токсины). Обнаружение этих веществ осуществляется различными методами, включая измерение хемилюми-несценции плазмы крови, интенсивность которой снижается в присутствии полипептидных токсинов.
Увеличение объема (набухание) клеток. Увеличение объема клеток -один из наиболее ранних признаков ее повреждения, который проявляется, например, при не-
Часть I. ОБЩАЯ НОЗОЛОГИЯ
достатке кислорода в ткани - тканевой гипоксии. Сохранение нормальной формы и объема клеток связано с состоянием цитоскелета и поддержанием определенного соотношения между осмотическим давлением белков и электролитов внутри и вне клетки. При этом форма клетки эпределяется в значительной мере цитоскелетом, тогдакак объем - поддержанием осмотического баланса.Поскольку все биологические мембраны хорошо проницаемы для воды, но плохо проницаемы для большинства растворенных в воде веществ, включая соли, клетки, так же как и внутриклеточные структуры, например митохондрии,обладают свойством осмометра: их объем изменяется при изменении концентрации ионов в молекул внутри и вне клетки или органеллы. При этом строго поддерживается соотношение концентраций всех ионов и молекул внутри и внеклетки. Как только в клетке начинают накапливаться новые ионы и молекулы, ее объем ■•врастает, поскольку вода входит внутрь. Выкачивание ионов мембранными насосами и обменниками сопровождается уменьшением ее объема за счет самопроизвольного выхода избытка воды.
В нормальной клетке имеется, как правило, избыточное по сравнению с окружающей средой количество белков, что приводило бы к появлению избыточного осмотического (онкотическо-)) давления и увеличению объема клетки, если бы одновременно не происходило удаление (вы-■ичивание) ионов натрия из клетки за счет ра-iaibiКа+-К+-АТФазы. Вместе с натрием, кото-1 выкачивается ионными насосами за счет энергиигидролиза АТФ, происходит выход ионов за счет электрического поля, создаваемо-(диффузией ионов калия и переносом Na*, так ак мембрана клеток хорошо проницаема для ионовхлора. Иначе говоря, натриевый насос ■*-К*-АТФаза) удаляет из клетки NaCl и сникает концентрацию ионов в ней, что приводит уменьшению клеточного объема. Этому провесу противостоит процесс самопроизвольного вступления натрия внутрь клетки: через дефект влипидном бислое, через натриевые каналы, арез переносчики, сопрягающие вход натрия с рнвепортомСахаров и аминокислот в клетку, ' Н~- и Ма+/Са2*-обменники. Таким образом, ззая клетка находится в состоянии динамического равновесия, при котором «протечка» елочной мембраны компенсируется постоянно.
ной работой ионной помпы (это так называемая leak and pump - гипотеза).
При патологии может происходить либо увеличение ионной проницаемости клеточной мембраны (возрастание «протечки»), либо нарушение работы ионных насосов (например, при недостатке энергообеспечения). В опытах с изолированными клетками печени, почек, мозга было показано, что отравление солями ртути или других тяжелых металлов приводит к увеличению ионной проницаемости мембраны клеток (увеличению «протечки») и возрастанию объема клеток (т. е. набуханию ткани). Увеличение объема клеток можно вызвать и другим способом: нарушив систему их энергообеспечения. Действительно, было показано, что объем клеток возрастает при гипоксии (например, при действии цианида или окиси углерода) и под влиянием разобщителей окислительного фосфорилирования, таких как динитрофенол.
Набухание клеток - процесс, далеко не безразличный для функционирования клеток и ткани в целом. Первым результатом этого оказывается сдавливание кровеносных сосудов и затруднение кровообращения. Так, при ишемии происходит набухание клеток и последующее общее возобновление кровообращения не сразу и не всегда приводит к восстановлению жизнедеятельности ткани, потому что кровь не проникает в мелкие кровеносные сосуды, сдавленные набухшими клетками. То же происходит при трансплантации органов. Иногда применяется предварительное промывание пересаженного органа гипертоническим раствором, который восстанавливает прежний объем клеток и нормализует микроциркуляцию.
Нарушение структуры и функций митохондрий
Нарушение биоэнергетических функций митохондрий - одно из наиболее ранних проявлений повреждения клеток. Например, после прекращения кровообращения происходит нарушение окислительного фосфорилирования в митохондриях через 20-30 мин в печени и через 30-60 мин - в почках. Приблизительно в эти же сроки появляются и другие признаки повреждения клеток.
Изучение нарушения функций митохондрий производится после выделения этих органелл из ткани; при этом важно не повредить митохонд-
Глава 3 / МЕСТНЫЕ И ОБЩИЕ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА ПОВРЕЖДЕНИЕ 71
рии в ходе их выделения. Один из способов изучения функции митохондрий - измерение скорости потребления кислорода суспензией орга-нелл в различных функциональных состояниях методом полярографии. На рис. 1 приведено изменение концентрации кислорода в среде инкубации изолированных митохондрий. Наклон кривой в каждый момент времени характеризует скорость потребления кислорода (дыхания) в данном состоянии. Эти величины принято обозначать как Vv V2, V3, V4 ит.д., где цифрами обозначены состояния по классификации Б. Чан-са. Наиболее информативны V3 - скорость дыхания митохондрий при окислительном фосфо-рилировании,т. е. в присутствии субстратов окисления, АДФ и ортофосфата, и К, - скорость дыхания митохондрий в присутствии субстратов окисления и ортофосфата, но вотсутствие АДФ (состояние дыхательного контроля).
Снижение потребления кислорода. Уменьшение скорости потребления кислорода митохондриями, связанное с нарушением работы переносчиков электронов, наблюдается при действии многих токсических соединений, например ионов тяжелых металлов, таких как ртуть или серебро, ряда гидрофобных соединений, различных производных углеводорода, при перекисном окислении липидов. Оно может быть также следствием набухания митохондрий и разрыва их наружных мембран, в результате чего из митохондрий выходит цито-хром с, который является одним из переносчиков электрона по дыхательной цепи.
Увеличение проницаемости
Время инкубации суспензии без доступа кислорода Рис. 1. Типичная кривая потребления кислорода митохондриями в различных состояниях |
внутренней митохондриальной мембраны.
Низкая скорость дыхания митохондрий в состоянии 4 (см. рис. 1) связана с тем, что высокий мембранный потенциал (создаваемый в отсутствие АДФ и при наличии кислорода и субстратов) препятствует переносу протонов через внутренние мембраны, связанному с работой дыхательной цепи, и тем самым останавливает поток электронов по этой цепи. Утечка ионов снижает мембранный потенциал и приводит к увеличению скорости дыхания (V4). Поэтому рост Vt - свидетельство увеличения проницаемости внутренних мембран митохондрий. В митохондриях К, растет при повреждении орга-нелл в результате гипоксии или пероксидации липидов.
Анализ полярографических кривых позволяет определить два взаимосвязанных показателя работоспособности митохондрий. Первый - это коэффициент Р/0, который рассчитывается как отношение
Р моли синтезированного АТФ
О моли поглощенного кислорода
Второй показатель - коэффициент дыхательного контроля (ДК), который находят как отношение
RK=VJV4.
Снижение ДК до единицы сопровождается снижением коэффициента Р/0 до нуля и является свидетельством разобщения процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях при их повреждении.
Снижение способности накапливать кальций. Параллельно разобщению окислительного фосфорилирования наблюдается потеря способности митохондрий к накоплению ионов кальция. В присутствии избытка субстратов дыхания и при наличии кислорода и ортофосфата митохондрии печени способны накопить в матриксе количество фосфорнокислого кальция, по массе превышающее массу митохондрий в сотни и даже в тысячу раз! Повреждение митохондрий приводит к падению разности потенциалов на митохондриальной мембране. Положительно заряженные ионы кальция, удерживаемые в матриксе электрическим полем, начинают выходить наружу из поврежденных митохондрий.
Часть I. ОБЩАЯ НОЗОЛОГИЯ
Разобщение окислительного фосфорилирова-ния и выход кальция из митохондрий имеют самые драматические последствия для клетки. Снижение уровня АТФ в клетке приводит к выключению ионных насосов, выходу калия и вхождению ионов натрия и кальция в клетку из окружающей среды. Это, в свою очередь, приводит к активации целого комплекса ферментных систем, активируемых ионами кальция, включая фосфолипазы, многие системы биосинтеза и протеинкиназы; метаболизм клетки вначале активируется, а затем дезорганизуется. Именно повреждение митохондрий является, согласно современным представлениям, тем переломным моментом, после которого изменения в клетке, вызванные повреждающим агентом, становятся необратимыми и клетка погибает.
Набухание митохондрий. Весьма важным морфологическим признаком повреждения митохондрий является их набухание. Набухание митохондрий наблюдается, например, в клетках миокарда при недостаточности сердца, а также при многих инфекционных, гипоксических, токсических и других патологических процессах. Набухание митохондрий происходит при помещении клеток в гипотоническую среду, под влиянием ионизирующей радиации, бактериальных токсинов, при действии химических ядови других патогенных агентов на клетку. Набухание приводит сначала к разрывам наружных мембран митохондрий, а затем - к их полному разрушению.
В опытах с изолированными митохондриями показано, что существует два типа набухания: пассивное и активное. В противоположность цитоплазматической мембране, сравнительно хорошо проницаемой для ионов калия и хлора, внутренние мембраны митохондрий непроницаемы для ионов, за исключением Са2' и, возможно, ионов железа. В изотоническом растворе КС1 неповрежденные митохондрии сохраняют свой объем, несмотря на то, что концентрация ионов калияи хлора внутри существенно меньше, чем снаружи: осмотическое давление внутри создается и другими ионами, а также белками мат-рикса. При одновременном увеличении проницаемости для ионов калия и хлора они начинают диффундировать в митохондрии, что приводит к повышению осмотического давления, входу воды и набуханию органелл, которое называется пассивным, так как не зависит от дыхания
и энергизации. К агентам, вызывающим пассивное набухание, относятся ионы тяжелых металлов, включая ртуть, серебро, свинец. Таким же действием обладает и избыточная активация перекисного окисления липидов в мембранах митохондрий.
В условиях живой клетки чаще имеет место иной тип набухания - активное набухание, связанное с работой цепи переноса электронов. Повреждение митохондрий происходит под действием малых доз тяжелых металлов, активации собственной фосфолипазы в условиях гипоксии, при перекисном окислении липидов и сопровождается прежде всего повышением проницаемости внутренней мембраны для катионов. В присутствии источников энергии (субстраты дыхания и кислород, АТФ) на мембранах митохондрий генерируется разность потенциалов величиной около 170-180 мВ со знаком «минус» в матриксе, под действием которой ионы К* поступают внутрь поврежденных митохондрий. Вместе с калием в матрикс поступает ортофосфат, который переносится в электронейтральной форме через внутреннюю мембрану с помощью специального белкового переносчика. Активное (т. е. связанное с затратой энергии) накопление фосфата калия в матриксе сопровождается набуханием митохондрий.
Ацидоз
Любое повреждение клетки сопровождается ацидозом ее цитоплазмы (рН падает до 6 и ниже). Первичный ацидоз повреждения клеток следует отличать от вторичного ацидоза в воспаленной ткани, который возникает значительно позднее (спустя несколько часов) после нанесения повреждения. Первичный ацидоз повреждения - следствие накопления в клетке определенных продуктов метаболизма (например, молочной кислоты). Первичный ацидоз в поврежденной ткани возникает при действии различных повреждающих агентов: механического воздействия, действия химических агентов (например, горчичного масла), бактериальных токсинов (дизентерийная палочка, гемолитический стафилококк). Ацидоз повреждения возникает в тканях также при гипоксии.
Изменение активности ферментов и рецепторов. Активация ферментов лизосом
В поврежденных клетках происходит выход
Глава 3 / МЕСТНЫЕ И ОБЩИЕ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА ПОВРЕЖДЕНИЕ
в цитоплазму и активация ряда гидролитических ферментов, в нормальных клетках заключенных в специальные фосфолипидные везикулы - лизосомы.Последние представляют собой образования диаметром порядка 0,4 мкм и содержат такие ферменты, как протеаза, рибонук-леаза, дезоксирибонуклеаза, кислая фосфатаза, гиалуронидаза и др. Различные повреждающие агенты, например эндотоксины бактерий брюшнотифозной группы, а также мелкие неорганические частицы (двуокись кремния, двуокись титана, алмазная пыль), попадая в лизосомы, разрушают их. Активация лизосомальных ферментов может происходить не только под действием тех или иных специфических факторов, но и в результате ацидоза, характерного для неспецифической реакции клетки на повреждающее воздействие. Одним из процессов, вызывающих выход лизосомальных ферментов, является также активация пероксидации липидов в лизосомальных мембранах. До сих пор нет окончательной ясности в вопросе о том, является ли активация лизосом механизмом удаления содержимого пораженной клетки или причиной ее повреждения при действии неблагоприятных факторов.
Дата добавления: 2015-03-19; просмотров: 2070;