Методы изучения свободных радикалов.

Радикалы обладают высокой реакционной спо­собностью и изучать их обычными химически­ми методами невозможно; стандартные проце­дуры вроде хроматографии или центрифугиро­вания совершенно бесполезны.

Биохимические анализы позволяют, правда, определять конечные продукты реакций, в ко­торых предполагается участие радикалов, но все­гда остаются вопросы: а действительно ли ради­калы участвовали в процессе и какие именно? Важную роль при решении таких вопросов иг­рает так называемый ингибиторный анализ. Классическим примером может служить приме­нение фермента супероксиддисмутазы (СОД). Этот фермент катализирует реакцию взаимодей­ствия (дисмутации) двух супероксидных ради­калов с образованием перекиси водорода и мо­лекулярного кислорода. Если добавление СОД тормозит изучаемый процесс, значит, для его протекания необходим супероксид-радикал и остается выяснить, в какой именно реакции этот радикал участвует (рис. 6).

Ингибиторный анализ используется и для изучения реакций с участием других радикалов. Так, для выяснения участия в каком-нибудь процессе реакций цепного окисления липидов (см. ниже) используют жирорастворимые «ло­вушки» липидных радикалов, которые «ведут» цепи окисления (рис. 7). К числу таких лову­шек относятся токоферол (витамин Е) и некото-

Супероксид-

дисмутаза

----------------- ►

-*- Fe^2>

Ловушки НО' ------------------- >

I

Церулоплазмин

Карнозин

Цепные реакции Рис. 6. Водорастворимые антиоксиданты

Глава 3 / МЕСТНЫЕ И ОБЩИЕ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА ПОВРЕЖДЕНИЕ

рые синтетические соединения, например трет-бутилгидрокситолуол (ионол). Водорастворимые радикалы эффективно «перехватываются» аскор­биновой или мочевой кислотой. Для «улавлива­ния» радикалов гидроксила (НО) используют маннитол или бензойную кислоту, а иногда -этанол. Однако далеко не всегда ловушки спе­цифичны: многие из них реагируют не только с радикалами, но ис достаточно активными мо­лекулами.

Прямым методом изучения свободных ради­калов можно считать метод электронного пара­магнитного резонанса (ЭПР), позволяющий об­наруживать молекулярные частицы и ионы ме­таллов, обладающие неспаренным электроном. По амплитуде и форме сигналов (спектров) ЭПР можно определять концентрацию частиц с неспаренными электронами и судить об их строе­нии.

К эффективным методам изучения реакций, идущих с участием радикалов, можно отнести метод хемилюминесценции (ХЛ). В основе его лежит то обстоятельство, что при взаимодействии радикалов друг с другом выделяется много энер­гии, которая может испускаться в виде фотонов (квантов света). Интенсивность такого свечения (ХЛ) пропорциональна скорости реакций, в ко­торой участвуют радикалы, и, следовательно, показывает изменение их концентрации в ходе изучаемого процесса.

В биологических системах скорости образования радикалов кислорода или липидных ра­дикалов в мембранах не так уж велики, зато очень велики скорости исчезновения этих ради­калов, поэтому концентрация радикалов в каж­дый данный момент времени (так называемая стационарная концентрация) обычно очень мала. Выход из положения заключается в использова­нии так называемых спиновых ловушек в мето­де ЭПР и активаторов свечения. В первом слу­чае к изучаемому образцу (например, к суспен­зии клеток, гомогенату ткани или раствору, где протекают реакции с участием свободных ради­калов) добавляют особые вещества - спиновые ловушки. Например, в качестве ловушки для радикалов гидроксила (ОН) используют фенил-бутилнитрон (ФБН).

При взаимодействии ловушки с радикалом происходит присоединение радикала к ловушке с образованием нового, стабильного радикала, по­лучившего название спинового аддукта (от анг­лийского слова add - добавлять, складывать). Сиг­налы ЭПР спиновых аддуктов разных радика­лов слегка различаются по форме. Это позволя­ет идентифицировать радикалы, образующиеся в изучаемой системе. Для улавливания других радикалов (скажем, супероксида) используют другие ловушки.

3.1.7. Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов

Все радикалы, образующиеся в организме человека, можно разделить на природные и чу­жеродные. В свою очередь природные радикалы можно разделить на первичные, вторичные и третичные (рис. 8).

Первичные радикалы- те радикалы, образо­вание которых осуществляется при участии оп­ределенных ферментных систем. Прежде всего к ним относятся радикалы (семихиноны), обра­зующиеся в реакциях таких переносчиков элек­тронов, как коэнзим Q (обозначим радикал как Q) и флавопротеины. Два других радикала - су-

Часть I. ОБЩАЯ НОЗОЛОГИЯ

пероксид ('00 ) и монооксид азота (N0) также выполняют полезные для организма функции.

Из первичного радикала - супероксида, а так­же в результате других реакций в организме образуются весьма активные молекулярные со­единения: перекись водорода, гипохлорит и гид­роперекиси липидов. Под действием ионов ме­таллов переменной валентности, в первую оче­редь Ре²¹', из этих веществ образуются вторич­ные радикалы(радикал гидроксила и радика­лы липидов), которые оказывают разрушитель­ное действие на клеточные структуры.

Для защиты от повреждающего действия вто­ричных радикалов в организме используется большая группа веществ, называемых антиоксидантами, к числу которых принадлежат ло­вушки, или перехватчики свободных радикалов. Примером последних служат альфа-токоферол, тироксин, восстановленный убихинон (QH₂) и женские стероидные гормоны. Реагируя с липидными радикалами, эти вещества сами пре­вращаются в радикалы антиоксидантов, которые можно рассматривать как третичные радикалы.

Наряду с этими радикалами, постоянно обра­зующимися в том или ином количестве в клет­ках и тканях организма человека, разрушитель­ное действие могут оказывать радикалы, появ­ляющиеся при таких воздействиях, как иони­зирующее излучение, ультрафиолетовое облуче­ние или даже освещение интенсивным видимым светом, например светом лазера. Такие радика­лы можно назвать чужеродными.К ним при­надлежат также радикалы, образующиеся из по-

павших в организм посторонних соединении, ксе­нобиотиков, многие из которых оказывают ток­сическое действие именно благодаря свободным радикалам, образующимся при метаболизме этих соединений.

Радикалы кислорода.Клетки-фагоциты (к которым относятся гранулоциты и моноциты крови и тканевые клетки - макрофаги), сопри­касаясь с поверхностью клеток, бактерий, начи­нают энергично выделять супероксид: радика­лы, образующиеся в результате переноса элект­рона от НАДФН-оксидазного ферментного ком­плекса, встроенного в мембрану клеток и внут­риклеточных везикул-фагосом, на растворенный молекулярный кислород

НАДФН + 20=0 ->

-> НАДФ⁺ + 2( 00) + Н⁺ (супероксид анион-радикал)

При этом каждая молекула НАДФН, окисля­ясь, отдает два электрона в цепь переноса элек­тронов, а каждый из этих электронов присоеди­няется к молекуле кислорода, в результате чего образуется супероксид анион-радикал (рис. 9).

Супероксидные радикалы, как мы увидим позже, могут нанести вред как самим фагоци­там, так и другим клеткам крови и, разумеется, микробам, вызвавшим активацию макрофага. Естественно, что все эти клетки стараются изба­виться от супероксид-радикалов, для чего они вырабатывают ферменты, называемые суперок-сиддисмутазами. Различаясь по строению актив­ного центра и структуре полипептидной цепи, все СОД катализируют одну иту же реакцию дисмутации супероксидного радикала:

род и перекись водорода. Судьба последней мо­жет быть разной (рис. 10).

В норме фагоциты используют перекись во­дорода для синтеза гипохлорита, выделяя спе­циальный фермент - миелопероксидазу (МП). Миелопероксидаза катализирует реакцию миелопероксидаза

Н₂0₂ + С1->• Н₂0+ СЮ (гипохлорит)

Гипохлорит разрушает стенку бактериальной клетки и тем самым убивает бактерии. Перекись водорода диффундирует в клетки, но там разру­шается в результате активности ферментов ка-талазы и глутатионпероксидазы (GSH-перокси-дазы), которые катализируют соответственно такие реакции:

каталаза

2НЮ₂ -» 2Н₂0+ 0₂

глутатионпероксидаза ->

В присутствии ионов двухвалентного железа перекись водорода разлагается с образованием гидроксильного радикала (НО):

Н₂0₂ + Fe²⁺ -» Fe³⁺ + НО+ НО

Эта реакция (известная как реакция Фентон) приводит к тяжелым последствиям для окружа­ющих клеток. Радикал гидроксила чрезвычай­но активен химически и разрушает почти лю­бую встретившуюся ему молекулу. Действуя на SH-группы, гистидиновые и другие аминокис­лотные остатки белков, НО' вызывает денатура­цию последних и инактивирует ферменты. В нуклеиновых кислотах НО' разрушает углевод­ные мостики между нуклеотидами и таким об-

разом разрывает цепи ДНК и РНК, в результате чего происходят мутации и гибель клеток. Вне­дряясь в липидный слой клеточных мембран, гидроксильный радикал запускает (иницииру­ет) реакции цепного окисления липидов, что при­водит к повреждению мембран, нарушению их функций и гибели клеток.

Гидроксильный радикал образуется не толь­ко в реакции Фентон, но и при взаимодействии ионов железа (Fe²⁺) с гипохлоритом (реакция Осипова):

СЮ + Fe²⁺ + Н⁺ -» Fe³⁺ + С1 + НО

Супероксидный радикал (00 )и продукты его метаболизма (Н₂0₂, НО', СЮ) называют актив­ными формами кислорода.

Окись азота.К числу радикалов, синтезиру­емых клетками, относится монооксид азота 'NO, называемый также нитроксидом. Нитроксид об­разуется клетками стенок кровеносных сосудов (эндотелия); эта реакция катализируется гемсо-держащим ферментом N0 -синтазой. N0 играет ключевую роль в регуляции тонуса сосудов и кровяного давления: его недостаток приводит к гипертензии, избыток - к гипотензии. Наруше­ние метаболизма фактора расслабления вызыва­ет заболевания, связанные с изменением кровя­ного давления.

' N0 выделяется также клетками-фагоцитами и вместе с супероксид-радикалами используется для борьбы с микробами (преимущественно гриб­ковой природы). Полагают, что цитотоксическое действие N0 обусловлено его реакцией с супер­оксидом

N= О+ 00+ Н⁺~> ONOOH (пероксинит-рит)

Часть I. ОБЩАЯ НОЗОЛОГИЯ

Пероксинитрит, образующийся в этой реак­ции, может разлагаться с образованием 'ОН:

О= N- О- ОН-> О= N- О+ ОН (ради­кал гидроксила)

Образование пероксинитрита и радикала гид­роксила приводит к повреждению клеток. По-видимому, одна из функций супероксиддисму-тазы состоит в предотвращении образования пе­роксинитрита за счет удаления супероксида из зоны образования окиси азота.

Радикал коэнзима Q.Биологическое окисле­ние субстратов клеточного дыхания, таких как глюкоза, пировиноградная и янтарная кислоты и другие, осуществляется, как известно, в два этапа. На первом этапе в цикле трикарбоновых кислот происходит последовательный отрыв ато­мов водорода от субстрата и образование восста­новленных форм пиридиннуклеотидов НАДН и НАДФН. На втором этапе электроны от НАДН и НАДФН переносятся по так называемой ды­хательной цепи на кислород. В состав дыхатель­ной цепи входят флавопротеиды, комплексы негемового железа, убихинон и гемопротеиды (цитохромы a, b и с ицитохромоксидаза). Схе­ма дыхательной цепи дана на рис. 11.

Важным звеном цепи переноса электронов служит убихинон (коэнзим Q) :

н,С-0

Н,С-0

радикал которого (семихинон, QH на рис. 11) образуется либо при одноэлектронном окислении

гидрохинон катион-радикал нейтральный

гидрохинона радикал (семихинон)

либо при одноэлектронном восстановлении уби­хинона (Q на рис. 11):

В норме этот радикал является рядовым уча­стником процесса переноса электронов, но при нарушении работы дыхательной цепи он может стать источником других, менее безобидных ра­дикалов, в первую очередь радикалов кислоро­да.

Основные стадии цепного окисления.Реак­ция цепного окисления липидов играет исклю­чительную роль в клеточной патологии. Она про­текает в несколько стадий, которые получили название инициирование, продолжение, развет­вление и обрывцепи (см. схему 3).

Инициирование цепной реакции начинается с того, что в липидный слой мембран или липопротеинов внедряется свободный радикал.

митохондрий Глава 3 / МЕСТНЫЕ И ОБЩИЕ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА ПОВРЕЖДЕНИЕ 83

Чаще всего это радикал гидроксила. Будучи небольшой по размеру незаряженной частицей, он способен проникать в толщу гидрофобного липидного слоя и вступать в химическое взаи­модействие с полиненасыщенными жирными кислотами (которые принято обозначать как LH), входящими в состав биологических мембран и липопротеинов плазмы крови. При этом образу­ются липидные радикалы:

НО + LH-> Н₂0 +L Липидный радикал (L) вступает в реакцию с растворенным в среде молекулярным кислоро­дом, при этом образуется новый свободный ра­дикал - радикал липоперекиси (LOO):

L + 0₂ -> LOO

Этот радикал атакует одну из соседних моле­кул фосфолипида с образованием гидропереки­си липида LOOH и нового радикала L':

LOO-+ LH -> LOOH + L-

Чередование двух последних реакций как раз и представляет собой цепнуюреакцию перекисного окисления липидов (см. схему 3).

Существенное ускорение пероксидации липи­дов наблюдается в присутствии небольших ко­личеств ионов двухвалентного железа. В этом случае происходит разветвление цепей в резуль­тате взаимодействия Fe²ⁱ с гидроперекисями ли­пидов:

Fe²⁺ + LOOH-> Fe³⁺ + НО + LOОбразующиеся радикалы LO' инициируют новые цепи окисления липидов (см. схему 3): LO + LH-> LOH +L ;L +0₂-> LOO-> и т.д.

В биологических мембранах цепи могут со­стоять из десятка и более звеньев. Но в конце концов цепь обрывается в результате взаимодей­ствия свободных радикалов с антиоксидантами (InH), ионами металлов переменной валентнос­ти (например, теми же Fe^2T) или друг с другом:

LOO + Fe²⁺ + Н⁺-> LOOH + Fe³⁺

LOO + InH -> In ■+ LOOH

LOO' + LOO'-> молекулярные продукты

Последняя реакция особенно интересна, по­скольку она сопровождается свечением (хемилюминесценцией). Интенсивность этой хемилюминесценции очень мала, поэтому ее иногда на­зывают «сверхслабым свечением». Интенсив­ность свечения пропорциональна квадрату кон­центрации свободных радикалов в мембранах, а

Схема 3 Цепная реакция перекисного окисления липидов

скорость перекисного окисления прямо пропор­циональна концентрации тех же радикалов. Поэтому интенсивность «сверхслабого» свечения однозначно отражает скорость липидной перок­сидации в изучаемом биологическом материале и измерение хемилюминесценции довольно час­то используется при изучении перекисного окис­ления липидов в различных объектах.

Повреждающее действие пероксидации ли­пидов. На рис.12 показаны основные мишени перекисного окисления липидов в мембранных структурах клеток. Повреждаются либо белко­вые структуры, либо липидный бислой в целом. В последнее время ученые уделяют все большее внимание взаимодействию мембран с нуклеино­выми кислотами в ядре и митохондриях. По-видимому, одним из результатов пероксидации

Часть I. ОБЩАЯ НОЗОЛОГИЯ

Наиболее известные антиоксиданты

Таблица 10

липидов может стать повреждение этих моле­кул со всеми вытекающими последствиями.

Наиболее чувствительны к переписному окис­лению липидов сульфгидрильные, или тиоловые, группы (- SH) мембранных белков: ферментов, ионных каналов и насосов. В ходе окисления тиоловых групп образуются радикалы (- S), ко­торые затем либо взаимодействуют друг с дру­гом с образованием дисульфидов (- SS-), либо связываются с кислородом с образованием суль­фитов и сульфатов (- S0₃ и - S0₄). Большую роль в патологии клетки играет также повреждение ионтранспортирующих ферментов (например, Ca^2t , М£²⁺-АТФазы), в активный центр которых входят тиоловые группы (рис. 12-1). Инактива­ция Са²⁺-АТФазы приводит к замедлению отка­чивания из клетки ионов кальция и ускорению их «протечки» в клетку(где их концентрация меньше). Это вызывает рост уровня ионов каль­ция в цитоплазме и повреждение клеточных структур.

Окисление тиоловых групп мембранных бел­ков приводит к появлению дефектов в мембра­нах клеток и митохондрий. Под действием элек­трического поля через такие дефекты в клетки входят ионы натрия, а в митохондрии - ионы калия. В результате происходит увеличение ос­мотического давления внутри клеток и митохон­дрий и их набухание. Это приводит к еще боль­шему повреждению мембранных структур.

Еще одним интересным примером может слу­жить окисление белков и последующее образо-

вание белковых агрегатов в хрусталике глаза, вызванное пероксидацией липидов. Процесс при­водит к помутнению хрусталика и может счи­таться одной из причин развития старческой и других видов катаракты у человека.

Наряду с белками и нуклеиновыми кислота­ми мишенью повреждающего действия перекис­ного окисления служит сам липидный бислой. Было показано, что продукты перекисного окис­ления липидов делают липидную фазу мембран проницаемой для ионов водорода и кальция (рис. 12-2; 12-3). Это приводит к тому, что в митохон­дриях окисление и фосфорилирование разобща­ются и клетка оказывается в условиях энерге­тического голода. Одновременно из митохондрий в цитоплазму выходят ионы кальция, которые повреждают клеточные структуры (см. выше).

Но, быть может, самый важный результат пероксидации - это уменьшение электрической стабильности липидного слоя,которое приво­дит к электрическому пробою мембраны собствен­ным мембранным потенциалом (рис. 12-4). Элек­трический пробой вызывает полную потерю мем­браной ее барьерных функций.

Клеточные системы защиты от поврежде­ния свободными радикалами.Свободные ради­калы преследовали живую материю с первых же моментов ее появления на Земле, и неудивитель­но, что в ходе эволюции клетки и организм в целом выработали нечто подобное глубокоэше-лонированной обороне, которая включает в себя ферменты и низкомолекулярные соединения, в

Глава 3 / МЕСТНЫЕ И ОБЩИЕ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА ПОВРЕЖДЕНИЕ

совокупности называемые антиоксидантами (табл. 10).

3.1.8. Стабильность липидного слоя мембран и явление электрического пробоя

Стабильность липидного слоя и электричес­кий пробой мембраны.В отличие от белков и нуклеиновых кислот, которые в клетке собира­ются каждый по своему чертежу сложнейшими молекулярными роботами, липидный слой мем­браны обладает способностью собираться сам по себе из молекул фосфолипидов и холестерина, если только они содержатся в водном растворе в достаточной концентрации. Это связано с осо­бым свойством молекул липидов, входящих в состав мембран, которое принято называть ам-фифильностью,т. е. сродством одновременно к воде (гидрофильность) и к неводным средам, та­ким как растительное масло или жидкий пара­фин (гидрофобность). Молекула фосфолипида (основной липид клеточной и внутриклеточных мембран) имеет форму сплющенного цилиндра (рис. 13, А), один (меньший) конец которого хорошо растворяется в воде («полярная голова»), а другой - в воде не растворяется («жирный хвост») (рис. 13, Б). В водной среде такие моле­кулы самособираются в липидный бислой (рис. 13, В), который сам на себя замыкается, обра­зуя везикулы - липосомы(рис. 13, Г).

Под влиянием тепловых движений молекул в липидном слое могут образоваться дефекты, которые приводят к образованию заполненных водой трещин и щелей (назовем их «порами»). Через такие дефекты могут проходить водора­створимые молекулы иионы. Однако их появ­ление крайне невыгодно с энергетической точки зрения, поскольку при этом граница раздела липид - вода сильно увеличивается, а это требу­ет затраты работы на преодоление силы поверх­ностного натяжения. С ростом радиуса поры энер­гия системы растет пропорционально радиусу в соответствии с уравнением:

АЕ = nrlo,

где г - радиус поры; Z ■ толщина мембраны; а -энергия образования границы раздела площадью 1м² (в системе СИ).

При наличии мембранного потенциала (т. е. разности потенциалов между водными фазами

по сторонам мембраны), который обозначается как ф_т, энергия образования поры снижается. Как показывает теория, в этом случае энергия системы изменяется с ростом поры по уравне­нию:

АЕ = nrlo ■ кг² е_оФ*_т (s„ - ej/ 21,

где е₀ - диэлектрическая постоянная, е_ц , е_т - ди­электрическая проницаемость для воды и липид­ного слоя мембран соответственно; <р_/( - мембран­ный потенциал.

Изменение энергии поры с ростом ее радиуса при трех разных мембранных потенциалах по­казано на рис. 14, В. Видно, что с ростом радиу­са энергия системы сначала растет, а затем на­чинает уменьшаться. Это означает, что после преодоления некоторого энергетического барье­ра рост поры будет происходить самопроизволь­но, пока мембрана вообще не разрушится. Вели­чина барьера снижается при увеличении мемб-

«Жирный хвост»

г Липосома

Рис. 13. Самосборка фосфолипидов в бислой

Часть I. ОБЩАЯ НОЗОЛОГИЯ

ранногопотенциала. При небольших потенциа­лах, существующих в живой клетке (70 мВ на щдаоплазматической мембране и 175 мВ на внут­ренней мембране митохондрий), этого не происходит,потому что барьер достаточно высок.

С ростом потенциала может наступить момент, когда в мембране начнут формироваться и расти ■орыи она будет разрушена. Такое явление но­ет название электрического пробоя мембраны.

О

Поверхность поры равна 2кН

Радиус поры, мкм

0 40 80 120

_

Рис. 14. Электрический пробой мембран: А - появле­ние в липидном бислое мембраны поры, заполнен­ной водой; В - размер внутренней поверхности поры пропорционален ее радиусу; В - энергия мембраны с

порой в зависимости от ее радиуса. Величина потенциального барьера при росте поры уменьшает­ся при увеличении потенциала на мембране; Г - возрастание тока в зависимости от потенциала пробоя

Величина потенциала, при котором начинается электрический пробой, называется потенциалом пробоя и обычно обозначается как U* или ф*. Величина потенциала пробоя, несколько разли­чающаяся для мембран с разным составом бел­ков и липидов, может служить количественной мерой электрической стабильности мембраны. Чем стабильнее мембрана, тем выше потенциал, который ее «пробивает» (т. е. ф*) .

Электрическая прочность различных мем­бранных структур. Явление электрического про­боя мембран изучалось многими авторами на искусственных мембранах и отдельных клетках. Мембраны обладают определенным сопротивле­нием R электрическому току I, которое при не­большой разности потенциалов ф между двумя сторонами мембраны является постоянной вели­чиной. Иными словами, для мембраны соблюда­ется закон Ома:

I =_Ф/Л.

Это означает, что зависимость между напря­жением на мембране ф и током через мембрану I - линейная. Однако такая зависимость сохраня­ется при сравнительно небольших величинах ф: обычно не выше 200-300 мВ. При определенной разности потенциалов на мембране (потенциале пробоя ф*) происходит резкое возрастание тока (рис. 14, Г). При постоянном мембранном по­тенциале, если он превышает критическое зна­чение, ток самопроизвольно нарастает во време­ни до полного разрушения мембраны.

На рис. 14 представлены результаты опыта на бислойных липидных мембранах. Аналогич­ные опыты были проведены на везикулярных мембранных структурах: фосфолипидных вези­кулах - липосомах, изолированных митохондри­ях и эритроцитах. В случае липосом и эритро­цитов потенциал на мембране создавался за счет разности концентраций проникающих ионов по сторонам мембраны, в случае митохондрий - за счет энергии окисления субстратов. Измерение мембранного потенциала осуществлялось различ­ными способами, например в случае митохонд­рий, - с помощью потенциалчувствительного флуоресцентного зонда. Явление пробоя мемб­ран наблюдалось во всех случаях. В табл. 11 приведены величины потенциалов пробоя мемб­ран всех этих объектов. Разумеется, потенциал пробоя во всех случаях выше потенциала, суще­ствующего на мембранах в живой клетке: иначе

Глава 3 / МЕСТНЫЕ И ОБЩИЕ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА ПОВРЕЖДЕНИЕ

Таблица 11 Электрические потенциалы (мВ) на мембранах клеток и потенциалы пробоя модельных и биологических мембран (A3. Путвинский, Т.В. Пучкова, ОМ. Париев, Ю.А. Владимиров)

все мембраны пробились бы своим собственным потенциалом и клетка не могла бы существовать. Однако запас электрической прочности невелик: всего 20-30 мВ. Это означает, что при снижении прочности мембраны может произойти ее «са­мопробой».

Электрический пробой как универсальный механизм нарушения барьерной функции мем­бран.Чрезвычайно важно, что электрическая прочность мембран, мерой которой служит по­тенциал пробоя, снижается под действием по­вреждающих факторов. Как уже говорилось, основными причинами нарушения барьерных свойств мембран при патологии являются: перекисное окисление липидов, действие мемб­ранных фосфолипаз, механическое растяже­ние мембран или адсорбция на них некоторых белков.Изучение влияния этих действующих факторов на электрическую прочность мембран показало, что все они снижают потенциал про­боя мембран (рис. 15).

При повреждении мембранных структур про­исходит снижение потенциала пробоя <р* и мо­жет сложиться ситуация <р* < ф, когда мембрана будет «пробиваться» собственным мембранным потенциалом. К чему это приводит в условиях живой клетки? Предположим, клетку облучают

ультрафиолетовыми лучами, под влиянием ко­торых в липидных мембранах активируется перекисное окисление. В неповрежденных мито­хондриях потенциал на мембране равен 175 мВ, а потенциал пробоя составляет около 200 мВ (см. табл. 11). В процессе активации перекисного окисления липидов потенциал пробоя начинает постепенно снижаться, и как только он достига­ет значения 175 мВ, мембрана митохондрий «про­бивается» собственным мембранным потенциа­лом. То же происходит и при активации фосфо­липаз: снижение потенциала пробоя до величи­ны, равной существующему на мембране потен­циалу, приводит к электрическому пробою мем­браны и потере ею барьерных свойств. В услови­ях эксперимента на эритроцитах и митохондри­ях было показано, что осмотическое растяжение мембраны и добавление чужеродных белков, так же как и действие перекисного окисления и фосфолипазы, снижают потенциал пробоя мембран настолько, что они начинают «пробиваться» соб­ственным мембранным потенциалом.

Естествен вопрос, почему такие, казалось бы, разные воздействия, как перекисное окисление липидов, ферментативный гидролиз фосфолипидных молекул, механическое растяжение мемб­раны или адсорбция полиэлектролитов, приво-

Рис. 15. Снижение электрической прочности БЛМ при действии ультра­фиолетового излучения (УФ), фосфо-липазы А₂, пептидов, при растяже­нии мембраны, вызванном разностью гидростатического давления (ДР)

Часть I. ОБЩАЯ НОЗОЛОГИЯ

дят к одному и тому же результату - снижению электрической прочности (т.е. уменьшению ве­личины потенциала пробоя) мембраны? Теория электрического пробоя дает четкий ответ на этот вопрос. Самопроизвольному росту пор, случай­но зародившихся в липидном бислое, препятству­ют силы поверхностного натяжения на границе раздела фаз: липидный слой мембраны - окру­жающий водный раствор. Нужно приложить довольно большую разность потенциалов к мем­бране, чтобы преодолеть эти силы и вызвать рост поры. Все вещества, снижающие поверхностное натяжение (детергенты), облегчают самопроиз­вольный рост пор и снижают величину потен­циала пробоя. И продукты перекисного окисле­ния липидов, и продукты гидролиза фосфолипидов фосфолипазами (лизолецитины), и мно­гие белки снижают поверхностное натяжение на границе раздела фаз и таким образом уменьша­ют электрическую прочность мембраны. Меха­ническое растяжение мембраны действует сход­но, так как противодействует силам поверхност­ного натяжения. Таким образом, электрический пробой мембран оказывается универсальным механизмом нарушения барьерной функции мембран при патологии.

Мембранные системы защиты от электри­ческого пробоя.Известны два фактора, с помо­щью которых живые клетки повышают элект­рическую стабильность своих мембранных струк­тур: асимметричный поверхностный потенци­али холестерин.

Поверхностный потенциал возникает на мем­бране в случае появления на поверхности липидного слоя заряженных химических группи­ровок, например таких, как карбоксил или фос­фат. Непосредственно на липидный бислой дей­ствует потенциал, равный разности величины мембранного потенциала (т.е. потенциала меж­ду водными средами, омывающими мембрану) и поверхностного потенциала (рис. 16). За счет нео­динаковой плотности зарядов на поверхностях мембраны реальная разность потенциалов, при­ложенная к липидному бислою, может быть боль­ше или меньше трансмембранной разности по­тенциалов. В большинстве биологических мемб­ран заряды распределены между поверхностя­ми таким образом, что разность потенциалов на липидном бислое меньше разности потенциалов между водными растворами, омывающими мем-

брану. Это снижает вероятность пробоя мембра­ны разностью потенциалов, которая существует между водными фазами по сторонам мембран в живых клетках.

Второй фактор, повышающий электрическую прочность мембран, - это холестерин. Было по­казано, что включение молекул холестерина в фосфолипидный бислой весьма заметно увели­чивает электрическую прочность мембран, т. е. повышает потенциал пробоя (см. рис. 14, Г). Осо­бенно заметно действие холестерина на повреж­денные мембраны. Защитные свойства холесте­рина против электрического пробоя мембраны можно объяснить влиянием холестерина на вяз­кость липидного бислоя. Известно, что введение холестерина в фосфолипидный бислой может по­высить вязкость последнего в 2-3 раза. Это при­водит к замедлению образования и роста дефек­тов (пор) в липидном бислое мембран. Как уже говорилось, именно образование и увеличение де­фектов в липидном бислое под действием при­ложенного электрического поля лежит в основе явления электрического пробоя.

Нарушение структурных (матричных) свойств липидного бислоя.Наиболее изучены три характеристики липидного слоя мембран, от которых зависят его свойства как жидкой фазы (матрицы), обеспечивающей функционирование мембранных белков и рецепторов: поверхност­ный заряд, вязкость и площадь липидного слоя.Все эти характеристики исследуются с помощью флуоресцентных и спиновых зондов.

Перекисное окисление липидов и действие мембранных фосфолипаз приводят к накоплению в липидной фазе мембран полиненасыщенных жирных кислот, которые придают мембране при нейтральных рН отрицательный заряд. Увели-

Глава 3 / МЕСТНЫЕ И ОБЩИЕ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА ПОВРЕЖДЕНИЕ

сятся к числу причин того, почему перекисное окисление липидов в районе сосудистой стенки способствует развитию атеросклероза.