КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

Определения:

Рост – это увеличение размеров, биомассы за счет усвоенных организмом питательных веществ.

Биомасса – это общая масса клеток микроорганизма в культуре.

Скорость роста – это интенсивность образования биомассы.

Развитие – это изменение морфологических и физиологических свойств в процессе онтогенеза.

Для осуществления любого биотехнологического процесса необходимы:

- культура микроорганизмов;

- питательная среда;

- аппаратура для выращивания и проведения вспомогательных операций;

- средства контроля и управления процессом.

Культивирование является основной стадией технологического процесса и во многом определяет количественные и качественные характеристики производства препаратов. На стадии культивирования осуществляется накопление, как самой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микроорганизмов.

В промышленных условиях используют: поверхностный, или твердофазный способ, и глубинный, или жидкофазный способ выращивания микроорганизмов.

Поверхностный осуществляется на твердых, сыпучих средах или на поверхности тонкого слоя жидкости. Пригоден только для аэрофилов. Основой питательной среды служат отходы различных производств (отруби, жмых, шелуха от семечек). Способ трудоемок, занимает много площадей, требует кондиционирования воздуха, трудно автоматизируется. Выращивают в основном грибы, получают ферментные препараты.

Более выгодный глубинный способ, осуществляемый в специальных аппаратах- ферментерах. Клетки культуры суспендированы в жидкости, находятся во взвешенном состоянии. Имеются устройства, регулирующие и контролирующие рН, температуру, наличие кислорода и т.д. Экономически более выгоден, но необходима работа с культурой, чтобы повысить активность ферментов.

Поверхностное культивирование всегда периодическое; глубинное может быть периодическим и непрерывным.

Суть периодического состоит в том, что культура выращивается на несменяемой питательной среде. Весь объем среды загружают сразу в аппарат, вносят посевной материал (споры, вегетативные клетки), перемешивают и ведут ферментацию (выращивание) до определенного количества биомассы или продукта метаболизма. В этом случае создается закрытая биологическая система, что имеет определенные недостатки.

Преимущества непрерывного выращивания:

1) Процесс идет с равномерной скоростью выращивания

2) Однородность и стандартность полученного продукта

3) Высокая продуктивность

4) Полная переработка субстрата

5) Создается открытая система, которая легко автоматизируется.

В процессе роста культуры можно выделить 6 фаз:

1) лаг-фаза

2) переходная

3) логарифмическая (экспоненциальная)

4) затухающего роста

5) стационарная

6) отмирания

1.Лаг-фаза – фаза адаптации, культура не растет, но клетки увеличиваются в объеме за счет собственных ресурсов. Количество ДНК не увеличивается, т.к. клетки не делятся.

2.Достигнув определенного объема, клетки начинают делиться, наступает 2 фаза. Время между двумя последовательными делениями называется временем генерации. Если обозначить исходное число клеток через С₀, тогда через данное число генераций n, общее число клеток составит:

C_t=C₀*2ⁿ

3. Скорость роста растет от 0 до 1, достигает максимума, культура переходит в 3 фазу. Активно работает генетический аппарат, клетки интенсивно делятся. За короткий промежуток времени биомасса значительно увеличивается. Фаза короткая т.к. быстро потребляются питательные вещества, накапливаются продукты метаболизма.

4.Постепенно начинается голодание клеток и отравление их метаболитами (4 фаза).

5.Константа скорости роста снижается от 1 до 0 и наступает стационарная фаза. Она самая длинная. В культуре присутствуют разные клетки. Продолжительность до 24 часов.

6.Затем начинается отмирание.

Культивирование анаэробов сложнее, чем аэробов, так как их необходимо лишить доступа свободного кислорода воздуха. Для этого из питательной среды удаляют воздух, применяя различные способы:

1. Удаление кислорода механическим путем. Анаэробные микроорганизмы можно культивировать в обычных чашках Петри, помещая их сразу после засева в анаэростат, из которого затем откачивается воздух. Анаэростаты – это вакуумные металлические или стеклянные эксикаторы. Металлические анаэростаты имеют герметически закрывающуюся крышку и снабжены манометром. Они способны сохранять высокое разряжение в течение длительного времени. Стеклянные вакуумные эксикаторы имеют пришлифованную крышку с краном на шлифах для откачивания воздуха. Пришлифованные поверхности эксикатора во избежание проникновения в него воздуха покрывают специальной вакуумной смазкой.

2. Замещение воздуха в анаэростате азотом, аргоном, водородом или смесью азота с углекислым газом.

3. Культивирование в высоком столбике агара с глюкозой. При этом способе микроорганизмы растут на дне, защищенные от воздуха высоким слоем среды.

4. Удаление кислорода химическим способом достигается при его окислении различных веществ кислородом, содержащимся в среде и сосудах для культивирования.

5. Метод Виньяля – Вейона заключается в том, что посев производят в пробирку с расплавленным и остуженным до 45 градусов агаром. Содержимое пробирки перемешивают и набирают в пастеровскую пипетку при помощи груши, заполняя пипетку до самого верха. Необходимо следить, чтобы в пипетку не попали пузырьки воздуха. Тонкий конец пипетки запаивают и пипетку помещают в термостат. В толще агара вырастают изолированные колонии анаэробов.

6. Добавление в среду редуцирующих (окисляющих) веществ. Используют среду Китт – Тароцци, содержащую в качестве редуцирующих веществ 0,5% раствор глюкозы, кусочки печени или яичного белка. Перед посевом среду кипятят 20 минут на водяной бане для удаления из нее растворенного кислорода. Перед посевом в пробирку на поверхность питательной среды наливают стерильное масло слоем 0,5 – 1,0 см для защиты анаэробов от проникновения кислорода.

7. Биологический метод Фортнера. В чашку Петри наливают толстым слоем агар с 5% крови. Чтобы культуры не смешивались, по диаметру чашки делают желобок в агаре. На одну половину питательной среды засевают аэробы, на другую – анаэробы. Края чашки тщательно заливают парафином. Посевы ставят в термостат. Сначала вырастают аэробы, а после поглощения ими кислорода, находящегося в чашке, начнут развиваться анаэробы.

Культивирование актиномицетов, грибов, микоплазм, L-форм, спирохет и простейших принципиально сходно с культивированием бактерий. Для них разработаны специальные среды и подобраны режимы, соответствующие их потребностям.

По типу питания грибы являются гетеротрофами. В качестве источника углерода грибы могут использовать большинство органических веществ. Однако, некоторые грибы лучше используют глюкозу, другие – фруктозу или пентозу. В качестве источника азота грибы могут использовать такие органические соединения как белки, пептон, пептиды, аминокислоты, соли аммония, нитраты, азот атмосферы. Диапазон использования перечисленных источников азота у разных видов грибов неодинаков.

Для роста и жизнедеятельности грибов необходимы минеральные вещества. Кроме макроэлементов (углерода, кислорода, водорода, азота, серы, фосфора, калия, кальция, магния, железа) им необходимы и микроэлементы (марганец, цинк, медь, кобальт, никель и др.). Важную роль в физиологии грибов играют витамины. Потребность в витаминах у грибов зависит от ростовой реакции. В отношении питательных сред большинство грибов крайне непритязательны. Они хорошо растут на самых разнообразных субстратах: картофеле, моркови, сахарном агаре, глицериновом агаре. Оптимальный рост грибов происходит при температуре 26 – 28 градусов. В зависимости от состава питательной среды особенности культуральных свойств того или иного гриба могут варьировать.

Грибы культивируют с разными целями – для поддержания в жизнеспособном состоянии без потери функций и особенностей строения, для идентификации, получения продуктов метаболизма грибов, сохранения посевных культур и т.д. Подбор среды для культивирования грибов зависит от цели исследования и биологических особенностей микроорганизма.

Среды для культивирования грибов по составу ингредиентов бывают:

1. Природные – разнообразные субстраты растительного и животного происхождения (корнеплоды, зерно злаков, листья, стебли растений, органы и ткани животных).

2. Полусинтетические – это комбинированные среды из природных субстратов и химически известных компонентов.

3. Синтетические – состоящие из ингредиентов известного состава.