Качественное определение и идентификация

Для обнаружения алкалоидов в растительном сырье чаще всего используют общие (осадочные) реакции и хроматографию. Кроме того, учитывают еще некоторые свойства алкалоидов: их раствори­мость в кислотах и выпадение в осадок после подщелачивания, ще­лочную реакцию спиртовых растворов оснований алкалоидов и др. С целью идентификации алкалоидов проводят специфические (цвет­ные) реакции, микрокристаллоскопические реакции и хроматографи- ческий, спектроскопический, люминесцентный анализы и т. д.

Общие реакции на алкалоиды (реакции осаждения). Реакции осаждения позволяют установить наличие алкалоидов даже при незначительном их содержании. Основаны они на том, что алкалоиды при взаимодействии с некоторыми веществами образуют нераство­римые в воде соединения. Это главным образом соли тяжелых ме­таллов, комплексные иодиды, комплексные кислоты и некоторые органические соединения кислотного характера. Для проведения качественных реакций из растительного сырья обычно готовят кислотное извлечение. При добавлении соответствующих реактивов в присутствии алкалоидов тотчас или через некоторое время обра­зуется осадок. Обилие осадка зависит как от количественного содер­жания алкалоидов, так и от чувствительности их к реактиву. Однако следует учитывать, что с общими реактивами образуют осадки еще и некоторые другие органические соединения, которые могут со­держаться в неочищенных извлечениях (холин, бетаин, белки, про­дукты их разложения и др.). Поэтому, чтобы получить более досто­верные результаты, общие реакции проводят еще и с очищенными извлечениями.

Ввиду того, что чувствительность различных алкалоидов к «оса­дочным реактивам» неодинакова, реакции обычно проводят не с од­ним каким-либо реактивом, а с несколькими (5—7) различными реактивами. Наиболее часто используются следующие реактивы: Майера (раствор дихлориДа ртути и иодида калия), Вагнера и Бу- шарда (растворы иода в растворе иодида калия), Драгендорфа (раствор нитрата висмута основного и иодида калия с добавлением уксусной кислоты), Марме (раствор иодида кадмия в растворе иодида калия); раствор танина, растворы кремневольфрамовой, фосфорномо- либденовой, фосфорновольфрамовой, пикриновой кислот и др.

Специфические реакции на алкалоиды. Если необходимо уста­новить присутствие определенного алкалоида или определенной группы алкалоидов в растительном сырье, проводят специ­фические реакции (цветные) и микрокристаллоскопические реак­ции.

Специфические реакции проводят с индивидуальными алкалои­дами или с очищенной суммой алкалоидов.

Алкалоиды из растительного сырья извлекают 1—5%-ным раст­вором какой-либо кислоты (соляная, серная или другая). Кислот­ное извлечение подщелачивают раствором аммиака или другой щелочи и затем алкалоиды извлекают органическими растворите­лями (хлороформом, дихлорэтаном, этиловым эфиром и т. д.). Орга­нический растворитель отгоняют или выпаривают в фарфоровой чашке и с остатком проводят соответствующие реакции. В качестве специфических реактивов на алкалоиды при проведении реакций окрашивания довольно часто используют концентрированную H₂S0₄ и HN0₃, а также концентрированную H₂S0₄, содержащую формалин (реактив Марки), концентрированную H₂S0₄ с молибдатом аммония (реактив Фреде) и др. При проведении микрокристаллоскопических реакций — пикриновую, пикролоновую и стифниновую кислоты, роданидные и иодидные комплексы металлов и др.

Специфические реакции на индивидуальные алкалоиды подробно описаны в руководствах по фармацевтической и токсикологической химии.

Хроматографический анализ. Хроматография на бумаге и в тон­ком слое сорбента является ведущим аналитическим методом в фи- тохимическом анализе.

При проведении фитохимического анализа вообще и, в частности, анализа растительного сырья, содержащего алкалоиды, эти методы могут быть использованы как для обнаружения и идентификации алкалоидов, так и для контроля степени очистки и разделения суммы алкалоидов.

Хроматография на бумаге. Существует большое число различных методов «бумажной хроматографии» (БХ). Най- более простыми и часто применяемыми являются методы восходя­щей, нисходящей и радиальной хроматографии. При восходящей и нисходящей хроматографии на стартовую линию полосы хромато­графической бумаги наносят капилляром или специальной пипеткой исследуемое извлечение и раствор «свидетеля». Объемы испытуемого извлечения и раствора «свидетеля», наносимые на хроматограмму, зависят от концентрации извлечения и раствора, а также чувстви­тельности алкалоидов к реактиву.

Способ закрепления подготовленной хроматограммы в хромато­графической камере зависит от метода хроматографирования. Си­стема растворителей должна обеспечивать максимальное разделе­ние алкалоидов, содержащихся в извлечении. При соприкосновении хроматограммы с жидкостью растворитель начинает медленно рас­пространяться вдоль бумаги. Когда растворитель проходит через участок, где нанесена сумма алкалоидов, происходит растворение веществ, и они перемещаются вместе с жидкостью. На каждом уча­стке хроматограммы происходит многократное перераспределение вещества между подвижной и неподвижной фазой, и поэтому ско­рость перемещения веществ по бумаге различна и зависит от его коэффициента распределения. Расстояние между стартовой линией и фронтом растворителя может быть различным (20—40 см) и за­висит от разницы между R_f веществ, содержащихся в извлечении. Чем меньше разница между R_f, тем больше должно быть расстоя­ние от стартовой линии до фронта растворителя. Экспозиция обычно от 3 до 20 ч, что определяется маркой хроматографической:бумаги, системой растворителей и др. Чаще всего используют следующие системы растворителей; 1) н-бутанол — уксусная кислота — вода (5:1: 4); 2) н-бутанол — уксусная кислота — вода (10 : 2 : 5); 3) н-бутанол — соляная кислота — вода (100 : 4: вода до насыще­ния); 4) этилацетат — уксусная кислота — вода (11 : 21 : 85); 5) н-бутанол — пиридин — вода (10:2:5) и др.

Для обнаружения алкалоидов высушенную хроматограмму обрабатывают каким-либо реактивом, дающим с алкалоидами окрашенные соединения. Чаще всего для этого используют реактив Драгендорфа. При обработке хроматограммы этим реак­тивом появляются оранжевые или оранжево-красные пятна (алка­лоиды) на желтом фоне. Можно для обнаружения алкалоидов использовать пары иода (образуются бурые пятна)." Для обна­ружения стероидных алкалоидов можно использовать насыщен­ный хлороформный раствор треххлористой сурьмы с последую­щим нагреванием при 105 °С. Появляется кирпично-красное окра­шивание.

Хроматография в тонком слое сорбента. Тонкослойная хроматография (ТСХ) может быть использована для идентификации и при количественном определении алкалоидов в растительном сырье. Хроматографирование проводят на пластин­ках с закрепленным и незакрепленным слоем сорбента. В качестве сорбента используют «оксид алюминия для тонкослойной хромато­графии», силикагель марки КСК и др.

Для приготовления пластинок с закрепленным слоем сорбента в качестве фиксатора применяют CaS0₄ • V₂H₂0; основой служат стеклянные пластинки размером 12—20 X 8—15 см.

Извлечение и раствор «свидетеля» наносят капилляром или специальной пипеткой на стартовую линию, которая отстоит от ниж­него края пластинки на 1,5—2 см. Для разделения обычно приме­няют способ восходящей хроматографии. Край пластинки погру­жают в жидкость, которую наливают в хроматографическую камеру. Слой жидкости должен быть около 5 мм. Пластинку с закрепленным слоем помещают в хроматографическую камеру, насыщенную па­рами растворителя, вертикально, с незакрепленным слоем — под углом 15—20°. Экспозиция от 30 мин до 1,5 ч.

Чаще всего используют следующие системы растворителей: 1) хлороформ — ацетон —диэтиламин (5:4: 1); 2) хлороформ — диэтиламин (9 : 1); 3) н-бутанол — метиловый спирт —диэтиламин (17:1:2); 4) хлороформ — метиловый спирт — уксусная кислота (18:1: 1); 5) бензол — метиловый спирт (19 t 1); 6) хлороформ — этиловый спирт (9 : 1); 7) ацетон — раствор аммиака (95 I 5); 8) хло­роформ — этиловый спирт (8 : 2).

После высушивания ТС хроматограммы обрабатывают теми же реактивами, что и хроматограммы на бумаге.

Спектральный анализ. С целью идентификации алкалоидов кроме качественных реакций и хроматографического анализа опре­деляют температуру плавления, удельное вращение, брутто фор­мулу, молекулярную массу, получают ряд производных, определяют их константы. Кроме того, для идентификации алкалоидов широко используют УФ, ИК, ПМР, масс-спектры. При этом нет необходи­мости снимать одновременно спектры исследуемого вещества и известного образца, поскольку последний можно взять из литера­туры.

УФ, ИК, ПМР, масс-спектры особенно широко используются при установлении структуры алкалоидов, так как интерпретация спектров позволяет установить наличие или отсутствие сопряжен­ных двойных связей и различных функциональных групп (карбо­нильной, N-метильной, гидроксильной и др.), ароматического цикла и др. Так, например, в ИК спектре атропина (рис. 25) полосы погло­щения при 1740 см^-1 указывают на наличие карбонила сложноэфир- ной связи; 2940 см"¹ — спиртового гидроксила. В УФ спектре атро­пина (рис. 26) отмечаются Яп,_ах = 252, 258, 262 нм, характерные Для сопряженных двойных связей в ароматическом цикле.

Полосы поглощения при 3220—3480 см^-1 в ИК спектре морфина (рис. 27) типичны для фенольного и спиртового гидроксилов. В УФ
спектре морфина (рис. 28) Я,_тах = 284 нм указывает на присутствие ароматического цикла.

Методики качественного анализа. Приготовление из- влечения из растительного сырья, а) 1 г измель­ченного растительного сырья помещают в колбу вместимостью 100 мл, заливают 25 мл 1 %-ной НС1 и нагревают на кипящей водя­ной бане в течение 5 мин. После охлаждения извлечение фильтруют через бумажный фильтр (извлечение А).

б) 2 г измельченного растительного сырья помещают в колбу вместимостью 100 мл, добавляют 1 мл ГО %-ного раствора аммиака и

20 мл хлороформа и оставляют на 1 ч при периодическом перемешивании. Хлоро­формное извлечение отфильтровывают че­рез вату в делительную воронку вмести­мостью 100 мл и алкалоиды извлекают 15 мл 1 %-ной НС1 (извлечение Б).

Качественные реакции (общие реакции, реакции осаждения). Извлечение А или Б разливают в пробирки по 1 мл и в каж­дую пробирку осторожно, по каплям, до­бавляют соответствующий реактив на ал­калоиды. При наличии алкалоидов тотчас или через некоторое время должен обра­зоваться осадок.

Интенсивность осадка зависит как от количественного содержания алкалоидов, так и от чувствительности алкалоида к реактиву.*

Рно. 26. УФ спектр атро­пина

1. Реактив Майера. С большинством алкалоидов в слабокислых и нейтральных растворах этот реактив образует белый или желтоватый осадок. Чувствительность алкалоидов к этому реактиву весьма разли­чна: стрихнин и бруцин осаждаются в разведении 1 : 150 000, морфин — 1 : 25 000, а кофеин, колхицин реактив Майера не осаждает.

2. Реактивы Вагнера и Бушарда. С большинством алкалоидов в слабокислых растворах эти реактивы образуют бурые осадки.

Рио. 28. УФ спектр морфина

3. Реактив Драгендорфа. Многие алкалоиды в кислых раство­рах дают оранжево-красные или кирпично-красные осадки.

4. Реактив Марме. С алкалоидами реактив Марме дает белые или желтоватые осадки, часто растворимые в избытке реактива. Чувствительность некоторых алкалоидов к этому реактиву неве­лика. Атропин, колхицин, вератрин и некоторые другие алкалоиды осаждаются из сравнительно концентрированных растворов, а ко­феин этим реактивом совсем не осаж­дается.

5. Раствор танина. В подкислен­ных растворах алкалоиды дают с та­нином беловатые или желтоватые аморфные осадки.

6. Раствор кремневольфрамовой кислоты. Большинство алкалоидов весьма чувствительны к этому реак­тиву и в слабокислых растворах образуют беловатые осадки.

7. Раствор фосфор номолибденовой кислоты. Это один из наиболее чув­ствительных реактивов. С алкалои­дами он образует желтоватые осад­ки, которые приобретают через не­которое время синее или зеленое окрашивание вследствие восстанов­ления молибденовой кислоты.

8. Раствор фосфорновольфрамовой кислоты. Фосфорновольфра- мовая кислота со многими алкалоидами дает беловатые осадки.

9. Раствор пикриновой кислоты. Пикриновая кислота образует с рядом алкалоидов осадки (пикраты) желтого цвета. Некоторые алкалоиды пикриновой кислотой не осаждаются (кофеин, морфин,
аконитин, теобромин), другие же осаждаются только из концентри­рованных растворов (например, атропин).

10. Раствор пикролоновой кислоты. Со многими алкалоидами пикролоновая кислота дает желтые осадки (пикролонаты).

Приготовление реактивов. 1. Реактив Майера: 1,358 г дихлорида ртути растворяют в 60 мл воды, приливают раст­вор 5 г иодида калия в 10 мл воды и общий объем доводят водой до 100 мл.

. 2. Реактив Вагнера: 1,27 г иода растворяют в 100 мл раствора 2 г иодида калия в воде.

3. Реактив Бушарда: 1 г иода растворяют в 50 мл раствора 2 v иодида калия в воде.

4. Реактив Драгендорфа: раствор 1 — 0,85 г нитрата висмута основного растворяют в 40 мл воды и добавляют 10 мл уксусной кислоты; раствор 2—20 г иодида калия растворяют в 50 мл воды. Смешивают равные объемы растворов 1 и 2. К 10 мл полученной смеси добавляют 100 мл воды и 20 мл уксусной кислоты.

5. Реактив Марме: 10 г Cdl₂ растворяют в 100 мл 20%-ного го­рячего водного раствора K.I.

6. Раствор танина: 10 г танина растворяют в 90 мл воды и до­бавляют 10 мл этилового спирта.

7. Раствор кремневольфрамовой кислоты (Si0₂ • 12W0₃ • nH₂0): 1 г кремневольфрамовой кислоты растворяют в воде и объем доводят водой до 100 мл.

8. Раствор фосфорномолибденовой кислоты [Н,Р(Мо₂0₇)_в • Н₂0]: 1 г фосфорномолибденовой кислоты растворяют в воде и объем доводят водой до 100 мл.

10. Раствор фосфорновольфрамовой кислоты (Р₂0₅ • 12WO_sx х42Н_аО): 1 г фосфорновольфрамовой кислоты растворяют в воде и объем доводят водой до 100 мл.

10. Раствор пикриновой кислоты [C₆H₂(0H)(N0₂)_sh 1,23 г пик­риновой кислоты растворяют в 100 мл воды.

11. Раствор пикролоновой кислоты

[QH^NOj) .CsN₄(OH)(NH₂)(CH₃)]:

1 г пикролоновой кислоты растворяют в воде и объем доводят водой до 100 мл.

Хроматографический анализ. Приготовление извле­чения из растительного сырья. 1г измельченного растительного сырья (трава термопсиса ланцетовидного, семена термопсиса ланцетовидного, листья красавки, листья дурмана обык­новенного, семена дурмана индейского и др.) помещают в колбу вместимостью 100 мл, заливают 25 мл 1 %-ной НС1 и оставляют на 1 ч при периодическом перемешивании или нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин. После охлаждения извлечение фильт­руют через вату в делительную воронку вместимостью 100 мл. Фильтрат подщелачивают концентрированным раствором аммиака до щелочной реакции по фенолфталеину, и алкалоиды извлекают 5 мл хлороформа (извлечение В).

1. Хроматография на бумаге (трава термопсиса ланцетовидного, семена термопсиса ланцетовидного). На полоску хроматографиче- ской бумаги (длина 30—40 см, ширина 12 см) на стартовую линию, находящуюся на расстоянии 2—3 см от нижнего края, капилляром или специальной пипеткой наносят около 0,1 мл извлечения В из травы термопсиса и из семян термопсиса, растворы цитизина, ме- тилцитизина и пахикарпина. Расстояние от бокового края полоски хроматографической бумаги и между пятна­ми — 2 см. Диаметр пятен не должен пре­вышать 5 мм.

Полоску хроматографической бумаги с на­несенными на нее растворами (после высу­шивания) помещают в хроматографическую камеру, в которую предварительно (за сутки) налита разделительная система: м-бутанол — уксусная кислота — вода (5 : 1 : 4).

Нижний край хроматограммы погружают в жидкость примерно на 3—5 мм (экспози­ция — 14—15 ч).

После высушивания хроматограмму обра­батывают (опрыскивают из пульверизатора) реактивом Драгендорфа. На желтом фоне проявляются оранжевые или оранжево-крас­ные пятна (алкалоиды) (рис. 29).

2. Хроматография в тонком слое сорбента (трава термопсиса ланцетовидного, семена термопсиса ланцетовидного). На стеклянную пластинку (размер 12 X 9 см) с закреплен­ным слоем силикагеля марки- КСК на стар­товую линию, находящуюся на расстоянии 1,5 см от нижнего края, наносят капилля­ром или специальной пипеткой около 0,1 мл извлечения В из травы термопсиса, семян термопсиса, растворы цитизина, метилцити- зина, пахикарпина. Расстояние от бокового края и между пятнами около 1,5 см. Диаметр пятен не должен превышать 5 мм. После высушивания пластинку помещают в хро­матографическую камеру, в которую пред­варительно налита разделительная система: хлороформ — ацетон — диэтиламин (5:4i 1). Экспозиция 30—40 мин. После тщательного высушивания хроматограмму обрабатывают (опрыскивают из пуль­веризатора) реактивом Драгендорфа. На желтом фоне появляются оранжевые пятна (алкалоиды) (рис. 30).

3. Хроматография в тонком слое сорбента (листья красавки, семена дурмана индейского). На стеклянную пластинку (размер 12x9 см) с закрепленным слоем силикагеля марки КСК на старто­вую линию, находящуюся на расстоянии 1,5 см от нижнего края, наносят капилляром или специальной пипеткой около 0,1 мл извле­
чения В из листьев красавки, семян дурмана индейского, растворы гиосциамина, скополамина и атропина. Расстояние от бокового края и между пятнами около 1,5 см. Диаметр пятен не должен пре­вышать 5 мм. После высушивания пластинку помещают в хромато- графическую камеру, в которую предварительно налита раздели­тельная система: хлороформ — ацетон — диэтиламин (5:4:1) — система I или ацетон — раствор аммиака (95 : 5) — система II.

Рис. 31. Схема хромато­граммы (ТСХ) листьев красавки и семян дурма­на индейского (система1):

/— извлечение В из листьев красавки; 2— извлечение В из сенян дурмана индейс­кого; 3 — гиосциэмин; 4 — скополамин;В — атропин

Рис. 32. Схема хрома­тограммы (ТСХ) лис­тьев красавки и семян дурмана индейского (система II):

J— извлечение В из ли­стьев красавки; 2 — из­влечение В из семян дур­мана индейского; 3 — гиосдиамин; 4— скопо­ламин; 5 — атропин

Толщина слоя жидкости около 5 мм. Экспозиция 30—40 мин. После тщательного высушивания хроматограмму обрабатывают (опрыски­вают из пульверизатора) реактивом Драгендорфа. На желтом фоне появляются оранжевые пятна (алкалоиды), рис. 31 и 32.

Реактивы и оборудование: НС1 1%-ная; аммиак, конц. р-р; СН₃СООН; н-бутанол; хлороформ; ацетон; диэтиламин; кремневольфрамовая кислота; фосфорновольфрамовая кислота; фосфорномолибденовая кислота; пик­риновая кислота; пикролоновая кислота; танин; реактивы Майера, Бушарда, Вагнера, Марм'е, Драгендорфа; силикагель марки КСК; CaS0₄; цитизин; метил­цитизин; пахикарпин; гиосциамин; скополамин; атропин.

Фенолфталеиновая бумага; бумага хроматографическая марки «С»; бумага фильтровальная; воронки делительные вместимостью 100 мл; колбы плоскодон­ные вместимостью 100 мл; цилиндры мерные на 10, 50 и 100 мл; воронки стеклян­ные для фильтрования диаметром 5 см; пробирки стеклянные; камеры хромато- графические для ТСХ и БХ; пластинки стеклянные для ТСХ размером 12 X X 9 см; капилляры стеклянные; весы ручные; штативы для делительных воро­нок; штативы для пробирок; бани водяные лабораторные; пульверизатор.