Ферменты генетической инженерии

Ферменты генетической инженерии - это ферменты, позволяющие проводить различные манипуляции с молекулами ДНК: разрезать в определенных местах, соединять различные по происхождению фрагменты, синтезировать новые, не существующие в природе последовательности и т. д.

Среди ферментов ГИ выделяют:

ДНК-полимеразы. Чаще всего в ГИ используют фермент ДНК-полимеразу I, выделенную из Esherichia coli (кишечной палочки) или фага Т4. ДНК-полимераза I обладает способностью удлинять цепь ДНК путем присоединения комплиментарного нуклеотида. Это свойство фермента используется в ГИ для построения второй комплиментарной цепи ДНК, т е по сути - это удвоение ДНК.

Из некоторых вирусов выделена специфическая ДНК-полимераза - РНК-зависимая, названная ревертазой, с помощью ривертаз получают молекулы ДНК и РНК.

ДНК-лигаза - осуществляет одну функцию - соединение фрагментов ДНК путем восстановления фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами. Этот процесс назван лигированием. В ГИ для лигирования обычно используют ДНК-лигазу фага Т4.

Нуклеазы - это большая группа ферментов, катализирующих реакцию гидролиза молекул нуклеиновых кислот, в результате чего молекулы ДНК и РНК распадаются на фрагменты или отдельные нуклеотиды.

Нуклеазы по типу их действия делят на группы:

1. нуклеазы, действующие только на ДНК или РНК;

2. нуклеазы, действующие и на ДНК и на РНК одновременно (нуклеаза золотистой фасоли).

Рестриктазы- специфическая группа нуклеаз. В ГИ используется около 200 видов рестриктаз. Эти ферменты способны гидролизовать ДНК строго по определенным специфическим последовательностям - сайтам рестрикации. Каждая из рестриктаз узнает свой сайт рестрикации и разрезает ДНК либо внутри последовательности сайта рестрикации, либо в непосредственной близости от него. По характеру расщепления рестриктазы делят на несколько типов:

- рестриктазы I типа узнают сайт рестрикации, но расщепляют последовательность нуклеотидов ДНК на произвольном расстоянии от сайта узнавания (от нескольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеотидов). Такие рестриктазы в ГИ используют редко;

- рестриктазы III типа - похожи на рестриктазы I типа, они гидролизуют ДНК на расстоянии 20-35 нуклеотидных последовательностей от сайта узнавания и тоже используются в ГИ довольно редко;

- рестриктазы II типа - чаще всего используются в ГИ, у таких рестриктаз места рестрикации и сайты узнавания совпадают.

Рестриктазы II типа в зависимости от размера сайта и длинны получаемых фрагментов делят на 3 класса:

1. мелкощепящие - сайт рестрикации представлен 4 парами нуклеотидов;

2. среднещепящие - сайт рестрикации - 6-8 н.п.;

3. крупнощепящие - сайт рестрикации - 10-14 н.п.

Кроме того, некоторые рестриктазы II типа расщепляют молекулу ДНК симметрично, образуя так называемые «тупые» концы», другие - со сдвигом, с образованием «ступеньки», образуют так называемые «липкие» концы (рис. 16).

Фермент(рестриктаза)

-АТГЦААТТЦАТЦ- разрыв по оси симметрии

-ТАЦГТТААГТАГ-

Фермент(рестриктаза)

-АТГЦААТТЦАТЦ- разрыв со сдвигом

-ТАЦГТТААГТАГ-

Рис. 16. Расщепление молекулы ДНК с образованием «тупых» и «липких» концов

Фрагменты ДНК, имеющие комплиментарные «липкие» концы могут соединяться с помощью ДНК-лигаз и сайт рестрикации восстанавливается.