Конструирование рекомбинантной ДНК

Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных био­логических источников. Соединение фрагментов ДНК в единую молекулу производится несколькими методами, в зависящими от того, какие концы фрагменты сшиваемых ДНК.

Соединение фрагментов по одноименным «липким» концам.Некоторые рестриктазы разрывают молекулу ДНК, образуя симметричные ступеньки, разрыв находится на одинаковом расстоянии центра от сайта узнавания. Эти комплиментарные друг другу участки могут соединяться за счет спаривания комплиментарных оснований. Но любые два фрагмента независимо от происхождения, образовавшиеся под действием одной рестриктазы могут «слипаться» за счет образования водородных связей между комплиментарными основаниями. Однако после такого соединения целостность двойной спирали не восстанавливается, поскольку остается два разрыва в фосфодиэфирном остове. Полная целостность спирали восстанавливается только при действии ферментов ДНК-лигаз, т.е. ДНК-лигазы завершают образование рекомбинантной ДНК

Соединение фрагментов по «тупым» концам.«Тупые» концы фрагментов ДНК, полученные после действия рестриктаз соединяются также за счет ДНК-лигаз. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке «липкими» концами.

Однако «липкие» концы можно ферментативным путем присоединить к «тупым». Для этого используют фермент – концевую трансферазу из тимуса теленка. Процесс сшивки завершается действием ДНК-лигазы.