Стадии трансформации

Процесс трансформации протекает в несколько стадий.Вначале ДНК адсорбируется на клеточной стенке, затем проникает внутрь и, наконец, рекомбинирует с клеточной хромосомной ДНК.

Итак, первый этап - связываниеэкзогенной ДНК с поверх­ностью компетентных клеток. Адсорбированная на этом этапе ДНК не отделяется от клеток при их отмывании. Адсорбция ДНК происходит на специальных структурах, обеспечивающих её проникновение через клеточную стенку и плазматическую мембрану. В частности, на поверхности компетентной клетки НаеторЬПш тйиепхае образуются везикулярные структуры и меняется липидный и белковый состав клеточной стенки.

Связь между поверхностными структурами и ДНК нековалентная - при обработке детергентами или фенолом ДНК отделяется от клетки. Природным субстратом для связывания служит только двухцепочечная молекула ДНК.

Следующий этап - фрагментация,при которой обе цепи связанной ДНК подвергаются разрезанию, которое происходит в случайных точках, но приводит к образованию фрагментов с определенным распре­делением по размерам. В связанном состоянии ДНК остается чувствительной к воздействию ДНКазы, образуя на поверхности клетки вытянутую структуру. Средняя величина образующихся при разрезании фрагментов составляет примерно 19 т.п.н.

Третий этап - поглощениетрансформирующей ДНК. На этой стадии связанная с клеткой-реципиентом ДНК в течение 1-2 минут пол­ностью теряет чувствительность к ДНКазе. Считается, что это обусловлено либо транспортом ДНК через мембрану, либо проникновением её в участки, недоступные для действия нуклеаз. ДНК поглощается как линейная молекула со скоростью 50 - 200 п.н./сек. В процессе поглощения одна цепь трансфор­мирующей ДНК подвергается деградации под действием нуклеаз и внутрь бактериальной клетки проникает только одноцепочечная молекула ДНК в виде составляющих её фрагментов.

Наиболее детально этот этап трансформации описан у НаеторЫ1ш тйиепгае. Поглощение ДНК у данного микроорганизма носит характер высокоизбирательного процесса в отношении гомологичной ДНК. Распознавание гомологичной и гетерологичной ДНК обеспечивают присутствующие в ДНК этого микроба «сайты поглощения», состоящие из 11 п.н. и повторяющиеся через интервалы длиной 4 т.п.н. В этом процессе, а также в поглощении экзогенной ДНК и её защите от нуклеаз также участвуют везикулярные мембранные выросты, называемые трансфор-мосомами.Они локализованы преимущественно в точках контакта плазматической и наружной мембран. Добавление гомологичной ДНК вызывает переход трансформосом во внутреннее пространство клетки с потерей чувствительности ДНК к нуклеазам. После проникновения в цитоплазму происходит высвобождение ДНК из трансформосом.

Параллельно этому у НаеторЬПш тйиепгае возрастает способ­ность к рекомбинации - в хромосомной ДНК возникают одноцепочечные бреши и «хвосты», т.е. она как бы подготавливается для включения экзогенной ДНК.

Завершающий этап трансформации - интеграция ДНК,которая осуществляется по принципу «разрыв-воссоединение». В ДНК клетки-реципиента включается лишь одна цепь трансформирующей ДНК, которая спаривается с гомологичным участком ДНК в реципиентной клетке, с цепью, являющейся комплементарнойей. Продукт рекомбинации представляет собой спаренный трехцепочечный гетеродуплекс из донорной и реципиентной молекул ДНК. Поскольку донорная ДНК ранее была подвергнута фрагментации на поверхности клетки, в процессе её интеграции происходит ряд независимых рекомбинационных событий в различных участках реципиентной ДНК.

Затем в результате двойного кроссинговера между однонитчатой донорной ДНК и двунитчатой ДНК реципиента происходит образование рекомбинантной хромосомы реципиента. При этом в участке ДНК, ограниченном сайтами кроссинговера, одна нить ДНК имеет реципиентный сегмент, другая - донорный. Уже после первого раунда репликации ДНК образуются два типа клеток: исходные и трансформированные, которые несут ДНК донора.

Таким образом, первые стадии трансформации - связывание экзогенной ДНК, её фрагментация, поглощение и деградация одной цепи -осуществляются с равной эффективностью независимо от её гомологии с ДНК реципиента. Эффективность последней стадии трансформации, а именно интеграция чужеродной ДНК, напрямую связана со степенью гомологии между донорной и реципиентной ДНК.

В отличие от вышеуказанных грамположительных микро­организмов, у грамотрицательных колиформных бактерий состояния высокоэффективной природной компетентности в том виде, в каком оно было рассмотрено выше, вообще не существует. По-видимому, трансформация не служит у этих организмов важным механизмом обмена генетической информацией. Однако в связи с тем, что кишечная палочка имеет важное значение как модель для генетических исследований, поиску способов её трансформации были посвящены специальные работы.

Как удалось установить, обработка клеток кишечной палочки раствором СаС\2 или смеси других солей на холоду делает их компетентными для поглощения экзогенной ДНК в течение короткого периода нагревания. Другим способом создания компетентности у данного вида бактерий (и не только у них) является введение ДНК с помощью электропорации, при которой клетки подвергаются воздействию высоковольтного электрического заряда, что обеспечивает проникновение ДНК через клеточную мембрану. В отличие от существующего в природе высокоэффективного механизма трансформации с превращением экзогенной ДНК в линейную одноцепочечную форму, при искусственной компетентности клетки кишечной палочки поглощают кольцевую двухцепочечнуюДНК.

Трансформация служит хорошим инструментом для картирования хромосом, поскольку трансформированные клетки включают различные фрагменты ДНК. Определение частоты одновременного приобретения двух заданных характеристик (чем ближе друг к другу расположены гены, тем более вероятно, что они оба включатся в один и тот же участок ДНК) даёт информацию о взаиморасположении соответствующих генов в хромосоме. Таким образом, трансформацию активно используют для определения порядка расположения генов, расстояний между ними в молекуле ДНК и построения генетических карт.

Трансфекция

Частным случаем трансформации является трансфекция. Данное явление впервые было описано в 1964 году на примере ВасШш зиЫШз. Его сущность заключается в продуктивной инфекции бактерий данного вида ДНК, выделенной из лизирующих их фагов.

Как и в случае классической трансформации, чувствительными к трансфекции являются лишь те клетки, которые компетентны к восприятию трансформирующей ДНК.

Явление трансфекции также установлено при обработке клеток кишечной палочки ДНК, выделенной из разных кишечных фагов, а также в случае инфицирования растений табака инфекционной РНК, выделенной из вируса мозаичной болезни табака. Ряду исследователей удалось наблюдать формирование вируса оспы после инфицирования компетентных клеток млекопитающих ДНК, выделенной из оспенного вируса.

Механизм трансфекции зависит от рекомбинационной системы клеток-реципиентов и рекомбинационный механизм трансфекции отличается от рекомбинационного механизма трансформации. В частности, трансфекция

ВасШиз зиЫШз ДНК из фага Н1 требует объединения 4-5 молекул фаговой ДНК. Механизм компетентности клеток к трансформации и трансфекции одинаковый.

ЛЕКЦИЯ5