Получение 2-кето-L -гулоната — промежуточного продукта синтеза

L-аскорбиновой кислоты — с помощью рекомбинантной

Бактерии Erwinia herbicola

Для направленного изменения прокариот, синтезирующих определенные метаболиты, в принципе есть два пути. Во-первых, можно изменить активность или содержание одного или нескольких ферментов того или иного биосинтетического пути с тем, чтобы увеличить продукцию нужного метаболита. Во-вторых, в прокариотический геном можно ввести чужеродные гены, кодирующие ферменты, которые, используя эндогенный метаболит в качестве субстрата, обеспечат синтез метаболита, изначально не продуцируемого хозяйской клеткой. Такого рода манипуляции представляются достаточно простыми, однако далеко не всегда удается выделить нужный ген и подобрать подходящие условия для его экспрессии.

Чтобы создать бактерию, синтезирующую 2-кето-L-гулоновую кислоту, непосредственного предшественника витамина С в промышленном производстве этого витамина, Андерсон и др. выделили из Coiynebacteriuin ген фермента, катализирующего превращение 2,5-дикето-D-глюконовой кислоты в 2-кето-L-гулоновую кислоту, и ввели этот ген в клетки Erwinia sp. - бактерии, синтезирующей 2,5-дикето-D-глюконовую кислоту из D-глюкозы. Выделение этого гена осложнялось тем, что сам фермент практически не был изучен. Таким образом, прежде чем идентифицировать ген, нужно было очистить соответствующий белок и частично секвенировать его, а затем на основании данных об аминокислотной последовательности сконструировать зонды для гибридизации.

Это была одна из первых работ, относящихся к той области исследований, которую иногда называют инженерией метаболизма. В такого рода работах из одного микроорганизма в другой переносят гены, ответственные за какую-то часть метаболического пути, так что второй микроорганизм приобретает способность синтезировать новые метаболиты.

Биополимеры

Биополимеры — это высокомолекулярные соединения, синтезируемые живыми организмами. Некоторые из них обладают ценными физическими и химическими свойствами и могут использоваться в пищевой, перерабатывающей и фармацевтической промышленности. С возникновением технологии рекомбинантных ДНК появилась возможность создавать новые биополимеры, заменять синтетические продукты их биологическими аналогами, модифицировать уже существующие биополимеры с целью улучшения их физических и структурных характеристик, повышать эффективность соответствующих промышленных процессов, уменьшать их стоимость.

Создание рекомбинантной бактерии Xanthomonas campestris с целью получения ксантановой слизи

Xanthomonas campestris — грамотрицательная облигатно аэробная почвенная бактерия, синтезирующая ценный коммерческий биополимер ксантановую слизь, высокомолекулярный экзополисахарид. Его структурный каркас составляет линейная полимерная цепь из молекул глюкозы. К каждому второму глюкозному остатку присоединена трисахаридная боковая цепь, состоящая из одного остатка глюкуроновой кислоты и двух остатков маннозы. Ксантановая слизь имеет высокую вязкость, не разрушается в агрессивных физических и химических средах и по физическим и химическим свойствам напоминает пластик. В частности, ее можно использовать как стабилизирующий, эмульгирующий, загущающий или суспендирующий агент. Для успешного коммерческого производства ксантановой слизи необходимо выращивать X. campestris на недорогом и доступном источнике углерода. X. campestris дикоготипа эффективно утилизирует глюкозу, сахарозу и крахмал, но не лактозу. При производстве сыра в большом количестве образуется такой побочный продукт, как сыворотка. Она состоит из воды (94—95%), лактозы (3,5—4%) и небольших количеств белка, минеральных веществ и низкомолекулярных органических соединений. Огромные количества сыворотки дает молочная промышленность, и ее утилизация — это большая проблема. Часто сыворотку сливают в реки и озера, что приводит к уменьшению в них количества доступного кислорода и гибели многих водных организмов. Транспортировка сыворотки к местам захоронения мусора обходится очень дорого, к тому же серьезную проблему создает риск загрязнения ею грунтовых вод. Наконец, большие средства уходят на удаление твердых компонентов сыворотки. Все это заставило попытаться найти способы выгодной переработки сыворотки.

Сыворотку можно использовать как источник углерода при выращивании ценных промышленных микроорганизмов. Чтобы X. campestris приобрела способность расти на сыворотке, было проделано следующее. Гены lacZY E. coli, кодирующие ферменты b-галактозидазу и лактозопермеазу, встроили в плазмиду с широким кругом хозяев так, чтобы они находились под транскрипционным контролем промотора одного из бактериофагов X. campestris. Эту конструкцию ввели в E. coli, а затем перенесли из E. coli в X. campestris тройным скрещиванием. Трансформанты, содержащие плазмиду, синтезировали b-галактозидазу и лактозопермеазу, используя лактозу как единственный источник углерода, а также продуцировали в больших количествах ксантановую слизь, используя в качестве источников углерода глюкозу, лактозу и сыворотку. Подчеркнем еще раз, что X. campestris дикого типа синтезирует много ксантановой слизи, только когда растет на глюкозе.

Выделение генов биосинтеза меланина

Меланины образуют многочисленное семейство различных поглощающих свет биополимеров; их синтеризуют животные, растения, бактерии и грибы. Эти пигменты можно было бы использовать при изготовлении солнцезащитных экранов и покрытий, в качестве добавки к косметическим средствам. В настоящее время меланины получают в небольших количествах либо экстракцией из природных источников, либо путем химического синтеза. С помощью технологии рекомбинантных ДНК, возможно, удастся создать недорогое крупномасштабное производство меланинов с различными физическими свойствами.

Меланины — это нерегулярные полимеры, состоящие из остатков индола, бензотиазола и аминокислот. Первый этап их биосинтеза катализируется медьсодержащим ферментом монооксигеназой тирозиназы и представляет собой окисление тирозина до дигидроксифенилаланинхинона. Последние этапы полимеризации не являются каталитическими реакциями и в зависимости от химической природы нехинонных соединений, включающихся в полимерную структуру, дают конечные продукты разных цветов: черного, коричневого, желтого, красного или фиолетового.

Выделены и охарактеризованы гены биосинтеза меланина в бактериальных клетках Streptomyces antibioticus. Они содержат две открытые рамки считывания (ORF), одна из которых кодирует тирозиназу (мол. масса 30 600), а вторая (ORF438) - белок (мол. масса примерно 14 800) с неизвестными функциями. Чтобы проверить, нужны ли оба этих гена для синтеза меланина, гены сначала переклонировали в экспрессирующий вектор Е. соli, при этом одна конструкция содержала только ген тирозиназы, а другая — и ген тирозиназы, и ORF438. Вектор, несущий ген тирозиназы, обеспечивал синтез больших количеств тирозиназы, чем вектор, содержащий оба указанных гена. Однако оказалось, что уровень тирозиназы не имеет особого значения, а для биосинтеза меланина необходимы продукты обоих генов. Возможно, белок, кодируемый ORF438, поставляет ионы меди неактивному предшественнику тирозиназы апотирозиназе, которая активируется в их присутствии. В естественных условиях после образования дигидроксифенилаланинхинона при участии тирозиназы в полимер включаются различные низкомолекулярные соединения (нехиноны). С учетом этого можно изменять химические и физические свойства меланина, синтезируемого в клетках Е. coli с введенными в них ключевыми генами биосинтеза этого полимера, если добавлять в среду определенные низкомолекулярные соединения в разных количествах.

Микробиологический синтез животного биополимера с адгезивными свойствами

Весьма перспективной представляется также разработка недорогого способа получения белка с адгезивными свойствами, впервые выделенного из мидий Mytilus edulis. Этот водостойкий белок образует очень прочные нити, с помощью которых моллюски прикрепляются к разнообразным поверхностям. Сразу после секреции биополимера так называемой биссаловой железой между полимерными цепями образуются многочисленные поперечные сшивки, что затрудняет определение их аминокислотной последовательности. Это в свою очередь не позволяет установить нуклеотидную последовательность кодирующих их генов и синтезировать гибридизационные зонды. К счастью, удалось выделить внутриклеточный предшественник адгезивного белка (130 кДа-предшественник). Как показали биохимические исследования, он богат серином, треонином, лизином, пролином и тирозином. От 60 до 70% этих аминокислот содержат гидроксильную группу, при этом большинство остатков пролина и тирозина гидроксилированы до 3- или 4-гидроксипролина (Hyp) и 3,4-дигидроксифенилаланина (DOPA) соответственно. Кроме того, после определения аминокислотной последовательности выяснилось, что предшественник состоит в основном из повторяющихся декапептидов Ala-Lys-(Pro или Hyp)-Ser-(Tyr или DOPA)-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys.

Из библиотеки кДНК, которая была получена на основе мРНК, выделенной из биссаловой железы, была изолирована кДНК 130 кДа-предшественника адгезивного белка. И адгезивный белок, и его кДНК обладают весьма необычными свойствами, затрудняющими клонирование и экспрессию соответствующих генов и получение функционального адгезивного белка. Во-первых, кДНК содержит большое число повторов, что повышает частоту гомологичной рекомбинации и вероятность утраты части клонированной последовательности. Во-вторых, поскольку примерно 70% всех аминокислот белка приходится на долю пролина, лизина и тирозина, вряд ли его удастся получить в большом количестве вследствие ограниченности внутриклеточного пула аминоацил-тРНК.

Чтобы преодолеть все эти трудности, полноразмерную кДНК адгезивного белка или ее фрагменты встроили в дрожжевые экспрессирующие векторы и ввели эти векторы в дрожжевые клетки. После экспрессии были получены новые активные формы адгезивного белка мол. массой от 20 до 100 кДа, причем на их долю приходилось от 2 до 5% суммарного количества клеточных белков. Значительно более высокого уровня экспрессии удалось достичь после того, как был химически синтезирован ген адгезивного белка. Используя повторы ДНК, кодирующие декапептид адгезивного белка, создали синтетический ген длиной 600 п. н., который кодировал белок мол. массой примерно 25 кДа. Его основная повторяющаяся единица длиной 30 п. н. состояла из кодонов, оптимальных для экспрессии в Е. coli, а эффективная экспрессия происходила, когда он находился под контролем промотора фага Т7. Большинство микроорганизмов обладают лишь ограниченной способностью осуществлять посттрансляционное гидроксилирование аминокислот, так что образующийся белок бывает не до конца гидроксилирован. Так, некоторые из его тирозиновых остатков не превращаются в DOPA, что снижает число образующихся поперечных сшивок. Чтобы решить эту проблему, была создана система гидроксилирования in vitro, в которой бактериальная тирозиназа в присутствии аскорбиновой кислоты гидроксилировала остатки тирозина. Аскорбиновую кислоту добавляли в реакционную смесь для того, чтобы предотвратить окисление остатков DOPA в о-хинон. Этот процесс должен строго контролироваться, поскольку он приводит к сшиванию субъединиц адгезивного белка. Как и многие другие клеи или адгезивы, адгезивный белок необходимо активировать непосредственно перед использованием.

При окислении предшественника адгезивного белка и образовании сшивок белок может связываться с разнообразными поверхностями — из стекла, полистирола, коллагена и т. д. Прочность и специфичность связывания можно изменять добавлением к смеси адгезивных белков до окисления и образования сшивок других белков. Это позволяет создавать клеи с уникальными свойствами, в том числе и такие, которые можно будет использовать в медицине, в частности в стоматологии.

Микробиологический синтез каучука

Натуральный каучук, цис-1,4-полиизопрен, -это широко используемый биополимер, который получают из различных растений. Его биосинтез начинается с превращения простых сахаров и включает 17 ферментативных реакций. В ходе последней из них происходит полимеризация изопентенилпирофосфата с образованием аллилпирофосфата.

Ввиду большой коммерческой ценности каучука были проведены исследования, направленные на то, чтобы выяснить, можно ли использовать для его получения рекомбинантные микроорганизмы. Прежде всего с помощью мРНК из растения Hevea brasiliensis, синтезирующего каучук, была создана соответствующая кДНК-библиотека. Затем проведена гибридизация с коротким ДНК-зондом, синтезированным исходя из данных об аминокислотной последовательности одного из участков молекулы полимеразы каучука. Для того чтобы доказать, что клонированная кДНК действительно кодирует этот фермент, использовали антитела к очищенному ферменту. Теперь, используя этот клон кДНК, а также, возможно, другие гены биосинтеза каучука, можно попытаться синтезировать натуральный каучук микробиологическими методами. С другой стороны, с помощью этой кДНК можно также получить полимеразу каучука и создать каталитическую систему in vitro. В любом случае исследования, которые могли бы привести к разработке нового пути биосинтеза каучука имеет смысл продолжить.

Микробиологический синтез полигидроксиалканоатов

Полигидроксиалканоаты — это биодеградируемые полимеры, синтезируемые множеством микроорганизмов (прежде всего Alcaligenes eutphus) и использующиеся ими как внутриклеточный источник углерода и энергии. Они обладают разными свойствами в зависимости от состава и могут применяться для получения биодеградируемых пластмасс, используемых, например, для изготовления упаковочного материала. По оценкам, годовой объем продаж биодеградируемых пластмасс составляет примерно 1,3 млрд. долларов.

Из всех полигидроксиалканоатов наиболее полно изучена и охарактеризована поли(3-гидроксимасляная кислота). Это относится как к самому полимеру, так и к кодирующим его синтез генам A. eutrophus. Поли(3-гидроксимасляную кислоту), ее сополимер поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерат) и другой полиоксиалканоат, поли(3-гидроксивалериановую кислоту), получают в Великобритании в промышленном масштабе ферментацией при участии A. eutrophus.

Однако этот микроорганизм растет относительно медленно и использует лишь ограниченное число источников углерода, что делает производство довольно дорогим. Можно использовать другой путь: при перенесении генов биосинтеза этого полимера в Е. coli получаются быстрорастущие трансформанты, накапливающие в большом количестве (до 95% сухой массы клетки) поли(3-гидроксимасляную кислоту). Поли(3-гидроксимасляная кислота) синтезируется из ацетил-СоА в три стадии, катализируемые тремя разными ферментами. Оперон, содержащий эти гены, был встроен в плазмиду в составе фрагмента длиной 5,2 т.п.н., однако в отсутствие селективного давления, например при росте в отсутствие антибиотиков, примерно половина клеток Е. coli теряла данную плазмиду уже после 50 генераций. Это не очень существенно, когда масштабы культивирования малы, но становится серьезной проблемой при крупномасштабной или непрерывной ферментации. Чтобы обойти эту трудность, в плазмиду, несущую оперон поли (3-гидроксимасляной кислоты), встроили локус раrВ из другой плазмиды, который обеспечивал стабилизацию плазмид, обусловливая гибель клеток, не содержащих плазмиды после сегрегации. Модифицированные плазмиды оставались стабильными даже при конститутивном синтезе поли (3-гидрокси-масляной кислоты). Трансформанты Е. coli, синтезирующие данный продукт, образовывали лишь очень небольшое количество ацетата, гибельного для клеток, по-видимому, вследствие того, что весь избыточный ацетил-СоА превращался в поли(3-гидроксимасляную кислоту), а не в ацетат. Еще одно преимущество синтеза поли(3-гидроксимасляной кислоты) в Е. coli состоит в том, что когда ее экстрагируют щелочным раствором хлорноватистокислого натрия (калия), то она разлагается в меньшей степени, чем при экстракции из A. eutrophus. По-видимому, это связано с тем, что большая часть полимера, синтезируемого в Е. coli, находится в кристаллическом виде, в то время как в A. eutrophus — в аморфном. При этом полимеры, получаемые этими двумя способами, идентичны.

Поли (3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерат) аналогичен по своим свойствам широко использующемуся полипропилену, так что получение его микробиологическими методами может представлять коммерческий интерес. Однако штаммы Е. соli, в которых экспрессируются гены биосинтеза полимера, синтезируют только поли(3-гидроксимасляную кислоту), а не сополимер. Эту проблему можно решить, используя для экспрессии клетки Е. coli, несущие мутации в fadR и atoC. fadR ответствен за негативную регуляцию биосинтеза жирных кислот, a atoC — за позитивную регуляцию их поглощения. Роль локуса fadR в индукции биосинтеза сополимера неясна, но продукт гена аtоС влияет на синтез белков, кодируемых генами atoA и atoD и облегчающих поглощение бактериями пропионата из культуральной среды. Последний превращается в пропионил-СоА и затем реагирует с ацетил-СоА с образованием 3- кетовалерил-СоА, который в свою очередь может превращаться в 3-гидроксивалерил-СоА, включаемый в сополимер.

Заключение

Бактерии можно не только использовать как «фабрики» для синтеза белков типа рестриктаз, но и получать с их помощью новые продукты, изменяя метаболизм бактериальных клеток введением в них чужеродных генов или модификацией уже существующих. Можно создавать рекомбинантные микроорганизмы, способные синтезировать самые разные низкомолекулярные соединения: L-аскорбиновую кислоту, краситель индиго, аминокислоты, антибиотики, мономерные единицы различных биополимеров. Общая стратегия при этом состоит во введении в организм хозяина-специфических генов, клонированных в подходящем векторе, которые кодируют один или несколько ферментов, катализирующих не свойственные микроорганизму метаболические реакции или влияющих на осуществляемый им в норме биосинтез определенных соединений. По имеющимся данным, создание новых метаболических путей не является технически неосуществимым. Этот подход поможет создать необычные, более эффективные пути синтеза самых разных соединений.