Полипептид, обладающий действием лейкоцитарного интерферона человека, синтезируется в Е. coli.

В конце 70-х—начале 80-х гг. молекулярная биотехнология стала привлекать к себе внимание общественности и крупных инвесторов. Одним из биотехнологических продуктов был интерферон, на который в то время возлагали надежды как на чудодейственное средство против множества вирусных заболеваний и рака. О выделении кДНК интерферона человека и его последующей экспрессии в Escherichia coli сообщали газеты и журналы всего мира.

Некоторые особенности интерферона сделали выделение его кДНК особенно сложным. Во-первых, несмотря на то что интерферон был очищен более чем в 80 000 раз, его удавалось получать лишь в очень небольших количествах, поэтому в то время не была известна его точная мол. масса. Во-вторых, в отличие от многих белков интерферон не обладает легко идентифицируемой химической или биологической активностью: ее оценивали только по снижению цитопатического действия вируса животных на культуру клеток, а это сложный и длительный процесс. В-третьих, в отличие от инсулина было неизвестно, есть ли клетки человека, способные вырабатывать интерферон в достаточно больших количествах, т. е. существует ли источник мРНК интерферона. Несмотря на все эти трудности, в конце концов была выделена и охарактеризована кДНК, кодирующая интерферон. С тех пор было обнаружено несколько разных типов интерферонов. Были выделены гены нескольких интерферонов и показана их эффективность при лечении различных вирусных заболеваний, но, к сожалению, интерферон не стал панацеей.

Гибридные моноклональные антитела человека и мыши

Тот факт, что разные участки молекулы иммуноглобулина выполняют разные функции, позволяет модифицировать моноклональное антитело мыши таким образом, что оно приобретает некоторые сегменты антитела человека, сохраняя в то же время свою исходную антигенсвязываюшую специфичность. Такое гибридное антитело называют химерным. Первым участком моноклонального антитела мыши, который был заменен соответствующим участком антитела человека, былFc-фрагмент. Выбор объяснялся тем, что Fc-фрагмент антитела мыши выполнял роль эффектора иммунного ответа у человека недостаточно хорошо; кроме того, он с большой вероятностью индуцировал образование антител в организме человека. Чтобы снизить иммуногенность и усилить эффекторные функции, провели замену последовательностей ДНК, кодирующих Fv-области L- и Н-цепей иммуноглобулина человека, на аналогичные фрагменты специфического моноклонального антитела мыши. Такую замену можно осуществить разными путями: реплицировать ДНК in vitro с применением олигонуклеотидов в качестве затравки либо использовать субклонированные фрагменты ДНК. Сегменты ДНК, кодирующие химерные цепи, встраивали в экспрессирующий вектор и вводили в культуру В-лимфоцитов, из которой выделяли наработанные антитела.

Химерные антитела, несущие антигенсвязывающий участок моноклонального антитела мыши к поверхностному антигену клеток рака толстой кишки человека, тестировали на больных с раком толстой и прямой кишки. Антитела оставались в кровотоке примерно в шесть раз дольше обычных антител мыши, тем самым оказывая свое действие в течение большего времени. При этом лишь у одного пациента из 10 наблюдался слабо выраженный иммунный ответ. К сожалению, в этих испытаниях не удалось получить противоопухолевого эффекта антител: возможно, это было связано с введением их в слишком малых дозах или с тем, что раковый процесс находился на поздних стадиях. В опытах in vitro химерные антитела проявляли высокую эффекторную активность, что позволяет надеяться на успешное их применение в других случаях.

Конструирование химерных молекул, о которых шла речь выше, — это первый этап в сочетании моноклональных антител мышей и крыс, обладающих сходством с антителами человека. Другой подход состоит в замещении только CDR-участков человеческих антител фрагментами моноклональных антител грызунов. Такие «восстановившие форму» антитела человека могут стать эффективным терапевтическим средством, поскольку они по своей антигенсвязывающей способности приближены к исходным моноклональным антителам грызунов.

Моноклональные антитела грызунов, сходные с антителами человека, можно получить, выделив кДНК L- и Н-цепей из клеточной линии гибридомы грызунов и амплифицировав их вариабельные области с помощью ПЦР. В качестве праймеров для амплификации можно использовать олигонуклеотиды, комплементарные высококонсервативным сегментам ДНК, фланкирующим с 5'- и 3'-концов последовательность, кодирующую вариабельную область. Зная нуклеотидные последовательности кДНК вариабельных областей легкой и тяжелой цепей (V_L и v_h), легко определить границы CDR, основываясь на том, что соответствующие им последовательности гипервариабельны, в то время как каркасные области относительно консервативны. Исходя из данных о нуклеотидных последовательностях ДНК, кодирующих CDR грызунов, синтезировали шесть пар олигонуклеотидных праймеров. Каждая пара инициировала синтез ДНК, кодирующей одну из шести CDR грызунов: три, локализованных на L-цепи, и три — на Н-цепи. Кроме того, на 5'-конце каждого праймеpa находилось 12 дополнительных нуклеотидов, комплементарных фланкирующим последовательностям каркасных участков ДНК человека, по которым происходило встраивание CDR-ДНК грызунов. Далее с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза осуществляли последовательную замену CDR-ДНК человека амплифицированной CDR-ДНК грызунов — фактическую «пересадку» CDR от грызунов в каркасные участки молекулы антитела человека. Модифицированную таким образом кДНК антител встраивали в векторы экспрессии и трансформировали ими подходящие клетки-хозяева, обычно Е. coll или клетки млекопитающих, в которых и вырабатывались антитела.

Данный метод предполагает, что за антиген-связывающую способность антитела отвечают только CDR-участки, а не каркасные области. Однако, если связывание «гибридного» антитела с антигеном происходит недостаточно эффективно, может возникнуть необходимость в замене некоторых аминокислот в каркасных областях с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза.

К настоящему времени этим методом получено более 50 различных моноклональных антител, обладающих сходством с антителами человека. К сожалению, данная технология, являясь весьма эффективной и универсальной, довольно дорогостоящая и требует больших затрат времени. Возможно, более предпочтительным способом получения антител человека и их фрагментов окажется метод, основанный на использовании фаговых «комбинаторных» библиотек, созданных на основе мРНК, полученной из В-клеток неиммунизированных доноров.