В. Проба на индивидуальную совместимость

1.Завершающий этап подбора донора — проведение пробы на индивидуальную совместимость. В основе пробы на индивидуальную совместимость лежит лимфоцитотоксический тест. Для этого к лимфоцитам донора добавляют сыворотку реципиента. Цель исследования — выявить любые антитела, которые могут реагировать с антигенами HLA донора и вызвать сверхострое отторжение трансплантата. Сверхострое отторжение обусловлено взаимодействием антител с антигенами HLA донора, находящимися на эндотелии трансплантата. Образовавшиеся комплексы активируют комплемент, который повреждает эндотелий и тромбоциты, приводя к тромбозу сосудов трансплантата. Положительный лимфоцитотоксический тест свидетельствует о высоком риске не только сверхострого, но и острого и хронического отторжения трансплантата. Острое отторжение обусловлено образованием антител, хроническое — появлением цитотоксических T-лимфоцитов, направленных против антигенов донора. Сыворотка реципиента для проведения пробы на индивидуальную совместимость должна быть получена не более чем за 1 мес до исследования. Дополнительно можно исследовать более ранние пробы сыворотки — иногда это позволяет выявить антитела, которые присутствовали в сыворотке реципиента в низком титре, а к моменту последнего забора крови исчезли. В этом случае обычно исследуют пробу сыворотки, содержащей наибольшее количество антител к разным антигенам HLA. Единого мнения о целесообразности исследования сывороток, полученных более чем за 6 мес до проведения пробы, нет. Считается, что оно необходимо, если у реципиента ранее обнаруживались антитела ко многим антигенам HLA или в прошлом он уже перенес трансплантацию. При этом обычно исследуют 2—6 проб сыворотки. Ложноположительные результаты лимфоцитотоксического теста возможны при наличии в сыворотке реципиента аутоантител, перекрестнореагирующих с лимфоцитами донора. Присутствие аутоантител подтверждается при смешивании сыворотки реципиента с его собственными лимфоцитами. Аутоантитела не повышают риск отторжения трансплантата.

2.Для выявления в сыворотке реципиента антител к антигенам HLA донора дополнительно проводят следующие исследования.

а.Сыворотку реципиента смешивают с суспензией лимфоцитов и моноцитов донора и добавляют комплемент. Для повышения чувствительности исследования увеличивают время инкубации. Поскольку в суспензии содержится около 70% T-лимфоцитов и 30% B-лимфоцитов и моноцитов, положительный результат данного исследования свидетельствует о том, что в сыворотке реципиента присутствуют антитела к антигенам HLA как класса I, так и класса II.

б. Лимфоцитотоксический тест с T-лимфоцитамипозволяет выявить только антитела к антигенам HLA класса I. Поскольку выделить из крови T-лимфоциты относительно просто, это исследование широко распространено. Если в сыворотке реципиента обнаруживаются IgG к T-лимфоцитам, трансплантация от этого донора абсолютно противопоказана.

в. Лимфоцитотоксический тест с B-лимфоцитамипозволяет выявить антитела к антигенам HLA как класса I, так и класса II, поскольку B-лимфоциты несут на своей поверхности антигены обоих классов. Лимфоцитотоксический тест с B-лимфоцитами более информативен, чем с T-лимфоцитами, поскольку на поверхности B-лимфоцитов больше антигенов класса I. Исследование часто проводят с разными разведениями сыворотки реципиента. Это позволяет определить титр антител к антигенам HLA донора. Если он превышает 1:4, то высок риск сверхострого отторжения трансплантата.

г. Проточная цитофлюориметриятакже позволяет определить титр антител к антигенам HLA донора. Метод заключается в следующем. Лимфоциты донора инкубируют с сывороткой реципиента, после чего к смеси добавляют меченные флюоресцентной меткой антитела к иммуноглобулинам человека. Присутствующие в сыворотке донора антитела связываются с лимфоцитами, а затем — с мечеными антителами. Результат исследования выражают в виде гистограммы. По оси абсцисс откладывают интенсивность флюоресценции, по оси ординат — число флюоресцирующих клеток. На рис. 17.3 представлены гистограммы, полученные при исследовании отрицательного и положительного контролей, а также сыворотки, содержащей антитела к антигену HLA класса I. Использование моноклональных антител к уникальным антигенам клеток, например CD3 T-лимфоцитов или CD20 B-лимфоцитов, позволяет исследовать отдельные популяции клеток. Чтобы отличить эти антитела от антител к иммуноглобулинам человека, их метят разными флюоресцентными метками. Например, чтобы выявить антитела к антигенам HLA класса I, связавшиеся только с T-лимфоцитами, суспензию лимфоцитов и моноцитов донора смешивают с сывороткой реципиента, затем добавляют антитела к человеческим IgG, меченные флюоресцеином (зеленое свечение), и моноклональные антитела к CD3, меченные фикоэритрином (красное свечение). Таким образом, T-лимфоциты, несущие исследуемые антигены HLA класса I, одновременно испускают красное и зеленое свечение. Чувствительность проточной цитофлюориметрии примерно в 100 раз превышает чувствительность серологических методов. Однако высокая чувствительность приводит к тому, что помимо антител к антигенам HLA выявляется множество других антител сыворотки реципиента, реагирующих с лимфоцитами донора, например аутоантител. В связи с этим положительный результат проточной цитофлюориметрии при определении антител к антигенам HLA требует дополнительных исследований (см. гл. 17, п. II.В.2.ж).

д. Исследование с дитиотреитом и дитиоэритритом.Считается, что основную роль в отторжении трансплантата играют IgG, а не IgM. IgM часто (хотя не всегда) являются аутоантителами, направленными к антигенам, не относящимся к HLA. IgM вызывают отторжение трансплантата крайне редко (в большинстве лабораторий IgM к антигенам HLA не определяют). IgM связывают комплемент, что обуславливает положительный лимфоцитотоксический тест. Для инактивации IgM используют дитиотреит или дитиоэритрит, они разрушают дисульфидные связи между мономерами в пентамерной молекуле IgM. Если при исследовании антител к антигенам HLA в сыворотке, обработанной дитиотреитом или дитиоэритритом, получен отрицательный результат, то в ней отсутствуют IgG, которые могли бы вызвать отторжение.

е. Проба на индивидуальную совместимость при высоком и низком риске отторжения трансплантата. К группе больных с высоким риском отторжения трансплантата относятся реципиенты, ранее иммунизированные антигенами HLA (коэффициент серопозитивности превышает 15%, см. гл. 17, п. II.Б.1), и реципиенты, ранее перенесшие трансплантацию, независимо от коэффициента серопозитивности в данный момент. Следует помнить, что отсутствие антител к антигенам HLA в сыворотке реципиента не исключает его иммунизации этими антигенами. В этом случае после трансплантации органа активируются клетки памяти и синтез антител возобновляется. В связи с этим при высоком риске отторжения перед трансплантацией исследуются несколько проб сыворотки реципиента, полученных в разные периоды времени. Больным с высоким риском отторжения трансплантата обычно проводят лимфоцитотоксические тесты с T- и B-лимфоцитами и проточную цитофлюориметрию с использованием нескольких проб сыворотки. К группе больных с низким риском отторжения трансплантата относят реципиентов, которым трансплантацию проводят впервые, а также реципиентов, в сыворотке которых нет антител к антигенам HLA или они присутствуют в низком титре.

ж. Оценка пробы на индивидуальную совместимость (см. табл. 17.4).

1)У всех реципиентов исключают наличие аутоантител, поскольку они обуславливают ложноположительную пробу на индивидуальную совместимость. При выявлении аутоантител их инактивируют дитиотреитом или удаляют абсорбцией на лимфоцитах реципиента или другого человека и только после этого повторно проводят пробу.

2)Если в сыворотке реципиента обнаружены IgG к T-лимфоцитам донора, трансплантацию органа, полученного от данного донора, не проводят.

3)При положительном результате лимфоцитотоксического теста с B-лимфоцитами необходимы дополнительные исследования для определения класса антигенов HLA, против которых направлены антитела реципиента. В этом случае обычно проводят проточную цитофлюориметрию с T-лимфоцитами. Положительный результат этого исследования свидетельствует о том, что сыворотка реципиента содержит антитела к антигенам HLA класса I. Отрицательный результат проточной цитофлюориметрии с T-лимфоцитами указывает на присутствие в сыворотке реципиента антител к антигенам HLA класса II. Единого мнения о том, допустима ли трансплантация органов при наличии в сыворотке реципиента антител к антигенам HLA класса II, в настоящий момент нет. Однако у реципиентов с низким риском отторжения трансплантата и низким титром данных антител трансплантация обычно проходит успешно.

4)Если при положительном результате проточной цитофлюориметрии с T-лимфоцитами донора результаты лимфоцитотоксического теста с сывороткой реципиента и лимфоцитами донора отрицательны, результаты исследования оценивают с учетом того, к какой группе риска относится реципиент. Так, если реципиент относится к группе риска отторжения трансплантата, положительный результат проточной цитофлюориметрии служит противопоказанием к трансплантации органа, полученного от данного донора. В остальных случаях трансплантация возможна.

III. Иммуносупрессивную терапию проводят всем больным до и после трансплантации. Исключение составляют те случаи, когда донор и реципиент — однояйцовые близнецы. Современные подходы к иммуносупрессивной терапии предусматривают одновременное использование нескольких иммунодепрессантов и их назначение до и после трансплантации для профилактики и лечения отторжения трансплантата. В настоящее время в качестве иммунодепрессантов применяются кортикостероиды, азатиоприн, циклоспорин, моно- и поликлональные антитела. Эти препараты препятствуют активации иммунного ответа или блокируют эффекторные механизмы иммунитета.

А. Циклоспорин — один из новых, но уже нашедших широкое применение иммунодепрессантов. Его назначают до, во время и после трансплантации. Препарат ингибирует синтез интерлейкина-2, подавляя таким образом пролиферацию цитотоксических T-лимфоцитов. В высоких дозах циклоспорин обладает нефротоксическим действием, а при длительном применении вызывает пневмосклероз. Несмотря на это, по сравнению с комбинацией преднизона и азатиоприна циклоспорин снизил отторжение трансплантированной почки в течение 1-го года на 10—15%. Отторжение трансплантатов в течение 1-го года при применении циклоспорина составляет 10—20%. На отторжение трансплантата в более поздние сроки циклоспорин не влияет.

Б. Такролимус по механизму действия сходен с циклоспорином, но отличается от него по химическому строению. Такролимус угнетает активацию и пролиферацию цитотоксических T-лимфоцитов за счет подавления продукции интерлейкина-2 и интерферона гамма. Препарат эффективен в более низких дозах, чем циклоспорин, однако также обладает нефротоксическим действием, поэтому пока не получил широкого распространения. В настоящее время препарат проходит клинические испытания при трансплантации почки, печени и сердца. Предварительные результаты свидетельствуют, что такролимус высокоэффективен при остром и хроническом отторжении после трансплантации печени. Такролимус в большей степени, чем циклоспорин, отдаляет отторжение трансплантата и повышает выживаемость больных. Кроме того, назначение такролимуса позволяет снизить дозу кортикостероидов, а иногда и полностью отменить их.

В. Муромонаб-CD3 — это препарат мышиных моноклональных антител к CD3, тесно связанному с антигенраспознающим рецептором T-лимфоцитов человека. После связывания с антителом CD3 на время исчезает с поверхности T-лимфоцитов, что делает невозможной их активацию. Спустя некоторое время CD3 вновь появляется на поверхности T-лимфоцитов, однако остается блокированным муромонабом-CD3. Препарат применяется при отторжении трансплантата в тех случаях, когда неэффективны кортикостероиды. Показано, что он значительно снижает число лимфоцитов CD3 в крови и подавляет реакцию отторжения трансплантата. Муромонаб-CD3 применяется как для профилактики, так и для лечения отторжения трансплантата. Препарат обладает серьезными побочными действиями: он может вызвать отек легких и неврологические нарушения. У некоторых больных в сыворотке появляются антитела к муромонабу-CD3, инактивирующие его. Для оценки эффективности лечения измеряют число лимфоцитов CD3 в крови. Если трансплантат отторгается повторно, применение муромонаба-CD3 возобновляют только в отсутствие признаков иммунизации, для выявления которых необходимы специальные исследования (см. гл. 17, п. IV.В).

Г. Поликлональные антитела к лимфоцитам, такие, как антилимфоцитарный иммуноглобулин и антитимоцитарный иммуноглобулин, получают из сыворотки кроликов и других животных после иммунизации лимфоцитами или клетками тимуса человека. Механизм действия поликлональных антител заключается в разрушении лимфоцитов и снижении их числа в крови. Эти препараты применяются как с профилактической, так и с лечебной целью. Антилимфоцитарный и антитимоцитарный иммуноглобулины повышают риск инфекций. Возможны также другие осложнения, например тромбоцитопения, связанные с присутствием в препаратах антител разной специфичности. Лечение данными препаратами может быть причиной ложноположительного результата лимфоцитотоксического теста. Поскольку экзогенные антитела затрудняют выявление собственных антител реципиента к антигенам донора, во время лечения антилимфоцитарным иммуноглобулином это исследование не проводят. Активность антилимфоцитарного иммуноглобулина, как и других препаратов биологического происхождения, нестабильна.

IV. Иммунологические исследования после трансплантации

А. Диагностика отторжения трансплантата проводится регулярно у всех больных, перенесших трансплантацию. Надежных методов иммунологической диагностики отторжения трансплантата нет. Так, исследование показателей активации иммунного ответа, например определение цитокинов, малоинформативно, поскольку они изменяются при многих заболеваниях, в частности при инфекциях. Изменение соотношения лимфоцитов CD4 и CD8 также не отражает активности иммунного ответа на трансплантат. В ряде исследований показано, что при отторжении трансплантата в сыворотке реципиента появляются рецепторы к интерлейкину-2, однако связь между их уровнем и скоростью отторжения трансплантата пока не установлена. Единственным надежным методом диагностики отторжения трансплантата на сегодняшний день остается его биопсия.

Б. Определение абсолютного числа T-лимфоцитов в крови — лучший способ оценки эффективности муромонаба-CD3, антитимоцитарного и антилимфоцитарного иммуноглобулинов. Число T-лимфоцитов в крови определяют методом проточной цитофлюориметрии с помощью меченых антител к CD3. Поскольку разные препараты этих антител направлены к разным участкам молекулы CD3, результаты исследования с применением препаратов разных фирм могут различаться. Определение числа T-лимфоцитов в крови позволяет подобрать дозу и установить длительность применения моно- и поликлональных антител.

В.В сыворотке реципиентов, получающих муромонаб-CD3, могут появляться антитела, инактивирующие его. Если при введении высоких доз муромонаба-CD3 число лимфоцитов CD3 не снижается, определяют содержание антител к препарату. Уровень антител к муромонабу-CD3 измеряют с помощью проточной цитофлюориметрии по следующей методике: 1) микросферы, покрытые муромонабом-CD3, обрабатывают сывороткой реципиента; 2) добавляют антитела к человеческим иммуноглобулинам, меченные флюоресцентной меткой. Чтобы исключить предшествующую иммунизацию мышиными антителами, уровень антител в сыворотке реципиента определяют и до лечения. При необходимости уровень антител к муромонабу-CD3 определяют во время первого курса лечения и обязательно перед повторным назначением препарата. Имеются коммерческие наборы для определения уровня муромонаба-CD3 и антител к нему.

V. Контроль за приживлением трансплантата костного мозга

А.Приживление трансплантата костного мозга контролируют, определяя клетки с антигенами HLA донора в крови реципиента. Такое исследование возможно лишь в том случае, когда донор и реципиент различаются по HLA, что наблюдается редко, поскольку обычно при трансплантации костного мозга подбирают донора, полностью идентичного реципиенту по антигенам HLA. Различия по антигенам HLA наблюдаются в тех случаях, когда реципиентом является ребенок, а донором костного мозга — один из родителей. В этом случае реципиент и донор несут по одному одинаковому гаплотипу HLA. Такая трансплантация костного мозга возможна только при тяжелом комбинированном иммунодефиците, поскольку при этом заболевании иммунная реактивность снижена или отсутствует. Донорские лимфоциты в крови реципиента выявляют с помощью лимфоцитотоксического теста. Это возможно, если они составляют не менее 20% от общего числа лимфоцитов в крови реципиента. Если донор отличается от реципиента по антигенам HLA класса II, для их выявления используются молекулярно-генетические методы (см. гл. 17, п. II.А.2). Они более чувствительны, чем лимфоцитотоксический тест. Так, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов выявляет донорские лимфоциты, если их содержание в крови реципиента 5%, а определение специфических олигонуклеотидных последовательностей — если их содержание не более 0,1%.

Б.При трансплантации полностью совместимого по HLA костного мозга клетки донора можно отличить от клеток реципиента по генам, не относящимся к HLA. Синтезированы олигонуклеотидные зонды для генов, не входящих в HLA, а также для определенных тандемных последовательностей нуклеотидов. Генетическое типирование донора и реципиента по этим генам и тандемным последовательностям проводят перед трансплантацией. По выявленным генетическим различиям впоследствии определяют донорские клетки в крови реципиента.

В.Если реципиент и донор разного пола, за приживлением трансплантата можно следить, выявляя половые хромосомы. Мужские и женские клетки можно отличить друг от друга, вводя в изолированные ядра клеток меченные флюоресцентной меткой олигонуклеотидные зонды, комплементарные специфическим последовательностям ДНК X- и Y-хромосом. Этот метод позволяет выявить клетки донора в крови реципиента, но не определить их количество. Для подсчета клеток, содержащих X- и Y-хромосомы, а также другие хромосомы человека, применяют проточную цитофлюориметрию.

VI. Иммунологическая толерантность к трансплантату.Идеальный способ, с помощью которого можно предупредить отторжение трансплантата, а также избежать иммуносупрессивной терапии, — индукция толерантности реципиента к антигенам донора. Теоретически иммунологическую толерантность можно вызвать следующими способами: 1) удалением всех клонов лимфоцитов, которые реагируют с антигенами донора; 2) активацией специфических T-супрессоров, угнетающих иммунный ответ на антигены донора; 3) индукцией синтеза антиидиотипических антител, подавляющих гуморальный иммунный ответ на антигены донора; 4) угнетением экспрессии антигенов HLA на клетках трансплантата. В настоящее время для индукции толерантности к антигенам донора перед трансплантацией применяют 1) переливание реципиенту цельной крови донора; 2) переливание лейкоцитарной массы донора и облучение лимфоидных органов реципиента (неспецифическая иммуносупрессия); 3) комбинацию этих методов с иммуносупрессивной терапией. По некоторым сообщениям, описанные выше схемы лечения позволяют применять после трансплантации более щадящую иммуносупрессивную терапию. В экспериментах на животных показана возможность индукции толерантности к антигенам главного комплекса гистосовместимости при введении аллогенных клеток селезенки и костного мозга до, во время и в ранние сроки после трансплантации. Несмотря на обнадеживающие результаты исследования, возможность этого способа индукции иммунологической толерантности у человека пока не доказана. Возможно, проблема отторжения трансплантата будет решена с помощью новых методов молекулярной биологии и генетики.

Литература

1. Colombe B. W. Histocompatibility testing. In: D. P. Stites, A. I. Terr (eds.), Basic and Clinical Immunology (7th ed.). Norwalk, CN: Appleton and Lange, 1991. Pp. 295—311.

2. Dupont B. (ed.). Immunobiology of HLA, Vols. 1 and 2. Histocompatibility testing, 1987. New York: Springer-Verlag, 1989.

3. Schwartz B. D. The human histocompatibility human leukocyte antigen (HLA) complex. In: Stites D. P., Terr A. I. (eds.), Basic and Clinical Immunology (7th ed.). Norwalk, CN: Appleton and Lange, 1991. Pp. 45—60.

4. Terasaki P. I., Cecka M. (eds.), Clinical Transplants, 1991. Los Angeles: UCLA Tissue Typing Laboratory, 1991.

5. Tsuji K. et al. (eds.). HLA 1991, Vols. 1 and 2. Oxford University Press, New York, NY, 1992.

***********************************