Б. Исследование клеточного иммунитета

1. Исследование поверхностных антигенов T-лимфоцитов.Определение поверхностных антигенов T-лимфоцитов с помощью проточной цитофлюориметрии позволяет изучить их созревание, дифференцировку и активацию (см. табл. 18.8 и гл. 2).

2. Стимуляция T-лимфоцитов in vitro.Нарушения созревания и дифференцировки T-лимфоцитов при иммунодефицитах с недостаточностью клеточного иммунитета происходят на разных уровнях. Так, при тяжелом комбинированном иммунодефиците нарушается созревание T-лимфоцитов в тимусе, что проявляется отсутствием на поверхности T-лимфоцитов антигена CD2. При этом заболевании также возможны отсутствие CD3, CD4 и неспособность T-лимфоцитов синтезировать цитокины. При синдроме обнаженных лимфоцитов на мембране активированных T-лимфоцитов отсутствуют антигены HLA класса II. При синдроме Вискотта—Олдрича снижена экспрессия антигена CD43, участвующего в активации T-лимфоцитов. Тяжелые иммунодефициты с недостаточностью клеточного иммунитета сопровождаются выраженным нарушением функции T-лимфоцитов, хотя абсолютное и относительное число этих клеток может быть нормальным.

а.Для стимуляции T-лимфоцитов in vitro используют следующие вещества.

1) Митогены — фитогемагглютинин, конканавалин A и др. — вызывают неспецифическую (не обусловленную связыванием с антигенраспознающими рецепторами) активацию T-лимфоцитов.

2) Растворимые антигены — антигены Candida albicans, столбнячный анатоксин — связываясь с антигенраспознающими рецепторами T-лимфоцитов памяти, вызывают специфическую активацию этих клеток.

3) Аллогенные клетки(в смешанной культуре лимфоцитов) активируют T-лимфоциты, поскольку несут на своей поверхности антигены HLA класса II.

4) Антителак поверхностным антигенам T-лимфоцитов, участвующим в их активации, — CD2, CD3, CD43.

5) Химические вещества, например форболмиристатацетат (активирует протеинкиназу C) и иономицин (повышает содержание внутриклеточного кальция).

б.Активацию T-лимфоцитов обычно оценивают по следующим показателям.

1)Пролиферация.

2)Выработка цитокинов — интерлейкинов-2, -4, -5, интерферона гамма и фактора некроза опухолей.

3)Экспрессия маркеров активации — CD25 и антигенов HLA класса II.

4)Цитотоксичность.

в.Под действием митогенов, антигенов и аллогенных клеток покоящиеся T-лимфоциты активируются, превращаются в бластные клетки и начинают делиться. Таким образом, активацию лимфоцитов можно оценить по включению ³H- или ¹⁴C-тимидина в ДНК. Реакция лимфоцитов на стимулятор меняется в зависимости от дозы и продолжительности инкубации, поэтому перед проведением исследования необходимо построить нормальные кривые зависимости уровня включения изотопа от дозы стимулятора и времени инкубации лимфоцитов. Уровень радиоактивности клеток определяют с помощью сцинтилляционного счетчика и выражают в количестве импульсов в минуту. Результат оценивают по уровню радиоактивности нестимулированных (спонтанная пролиферация) и стимулированных лимфоцитов, а также по индексу стимуляции (отношение уровня радиоактивности стимулированных лимфоцитов к уровню радиоактивности нестимулированных лимфоцитов). Кроме того, можно вычислить отношение уровней радиоактивности стимулированных лимфоцитов больного и здорового человека. Спонтанная пролиферация лимфоцитов бывает повышена у больных, перенесших многократные переливания крови, больных аллергическими и аутоиммунными заболеваниями, при бактериальных и вирусных инфекциях, а также у новорожденных.

г. Смешанную культуру лимфоцитовприменяют для оценки способности T-лимфоцитов распознавать антигены HLA аллогенных B-лимфоцитов и моноцитов. Стимулирующие клетки (аллогенные B-лимфоциты) инактивируют облучением или митомицином. Реакция лимфоцитов больного оценивается по включению в ДНК меченого тимидина (см. гл. 17, п. II.А.3 и гл. 20, п. III.Б.2.а).

3.Для оценки клеточного иммунитета иногда используют иммунизацию динитрохлорбензолом. Его вводят внутрикожно и только с диагностической целью. Однако поскольку динитрохлорбензол оказывает сильное раздражающее действие и является канцерогеном, это исследование проводят редко.

4. Биохимические исследования. При подозрении на комбинированную недостаточность гуморального и клеточного иммунитета определяют активность аденозиндезаминазы и пуриннуклеозидфосфорилазы (участвуют в метаболизме нуклеозидов). При атаксии-телеангиэктазии почти всегда повышен уровень альфа-фетопротеина в сыворотке, что позволяет дифференцировать это заболевание с другими нервными болезнями. К редким метаболическим нарушениям, сопровождающимся недостаточностью клеточного иммунитета, относятся оротовая ацидурия и биотин-зависимая недостаточность карбоксилаз (проявляется алопецией и неврологическими нарушениями). При недостаточности транскобаламина II (участвует в транспорте витамина B₁₂) поражаются быстрообновляющиеся ткани, поэтому для этого заболевания характерны недостаточность гуморального иммунитета, нарушения кроветворения (анемия, тромбоцитопения), понос и отставание в развитии.

5. Генетические исследования.У больных с тяжелой недостаточностью клеточного иммунитета возможен химеризм (существование клеток разных генотипов в одном организме). Он возникает при попадании материнских клеток крови в кровь плода, переливании компонентов крови и трансплантации костного мозга. Если в крови больного содержатся клетки человека противоположного пола, химеризм легко выявить, обнаружив клетки с женским и мужским кариотипами. В остальных случаях проводят типирование клеток крови больного по HLA. Это исследование также позволяет выявить отсутствие антигенов HLA класса II на активированных T-лимфоцитах при синдроме обнаженных лимфоцитов.

6. Сканирующая электронная микроскопия выявляет T-лимфоциты, на поверхности которых нет микроворсинок, что характерно для синдрома Вискотта—Олдрича.

7. Биопсия тимусапроизводится в ряде случаев для подтверждения диагноза тяжелого комбинированного иммунодефицита. При недостаточности клеточного иммунитета в тимусе определяются скопления ретикулоэпителиальных клеток, отсутствие телец Гассаля и четкой границы между корковым и мозговым веществом, резкое снижение числа тимоцитов. Биопсию тимуса проводят хирурги, владеющие техникой этой операции.

8. Биопсия лимфоузлов.При недостаточности клеточного иммунитета в биоптате лимфоузла выявляется опустошение паракортикальной зоны. Из-за риска раневой инфекции и осложнений анестезии биопсию лимфоузлов проводят только в том случае, когда другие лабораторные исследования не позволяют подтвердить диагноз.

В. Исследование фагоцитовпоказано при хронических и рецидивирующих бактериальных инфекциях, если исследование гуморального и клеточного иммунитета не выявило отклонений от нормы. Недостаточность фагоцитов может быть обусловлена нарушением миграции, хемотаксиса, адгезии фагоцитов, а также нарушением собственно фагоцитоза. Кроме того, недостаточность фагоцитов может быть обусловлена дефицитом опсонинов (антител и комплемента) и нарушением метаболизма фагоцитов.

1. Тест восстановления нитросинего тетразолияприменяется в диагностике хронической гранулематозной болезни. Суть метода заключается в следующем: к фагоцитам добавляют желтый краситель нитросиний тетразолий, в норме при его поглощении метаболическая активность фагоцитов возрастает, нитросиний тетразолий восстанавливается, продукты этой реакции окрашены в синий цвет. О нарушении метаболизма фагоцитов судят по снижению интенсивности синего окрашивания. При выявлении нарушений определяют уровень цитохрома b558 и других белков фагоцитов.

2. Хемилюминесценция также позволяет оценить функциональную активность фагоцитов. В норме при фагоцитозе появляется большое количество свободных радикалов кислорода, окисляющих субстрат, например компоненты клеточной стенки бактерий. Окисление сопровождается излучением видимого или ультрафиолетового света. По интенсивности излучения можно судить о функциональной активности фагоцитов.

3. Оценка фагоцитарной активности — наиболее информативный способ исследования опсонинов и функционального состояния фагоцитов.