Биологическая фиксация азота бобовыми культурами при симбиозе.

Семена многих видов бобовых богаты белком. Они являются ценным сырьем для производства кормов и пищевых продуктов. Из растений умеренного климата можно назвать горох и фасоль. В тропических и субтропических зонах возделываются самые разнообразные культуры, включая сою, чечевицу, арахис. Многие бобовые – ценные пастбищные культуры, например, различные виды клевера. Они могут служить зеленым удобрением (люцерна), дают нам лесоматериалы, клеящие вещества, волокна, лекарства и пряности. Роль бобовых определяется еще и тем, что они способны фиксировать азот атмосферы в корневых клубеньках, которые формируются при участии почвенных бактерий рода Rhizobium. Образующиеся в них азотистые вещества необходимы для роста растений.

Об участии клубеньковых бактерий в фиксации атмосферного азота стало известно сравнительно недавно (примерно 100 лет назад).

Культура, из которой можно получать богатые белком пищевые продукты и которая не требует (или требует очень мало) азотных удобрений, несомненно выгодна, и бобовые стали важной сельскохозяйственной культурой в Европе, в Северной Америке и на других континентах. Установлено, что среди бобовых, играющих важную роль в сельском хозяйстве, примерно 98% видов могут образовывать клубеньки. У диких видов они чаще всего формируются при участии особых разновидностей бактерий-ризобиумов, существующих в природном местообитании.

Если какой-то вид бобовых долго растет на одном месте, это приводит к постепенному накоплению в почве азотфиксирующих бактерий. Урожай бобовых в значительной степени зависит от того, образовалась ли в данном месте эффективная ассоциация из растения и соответствующей разновидности Rhizobium. Нужный штамм не всегда присутствует в том месте, где предполагается выращивать данную культуру, и в таком случае его приходится вносить в почву.

Как только стала ясна роль симбиоза бактерий рода Rhizobium и бобовых, были разработаны способы внесения этих бактерий в почву для улучшения условий культивирования, их стали смешивать с семенами. Затраты на внедрение этого способа инокуляции невелики, транспортные расходы незначительны, а сами методы достаточно несложны, чтобы их можно было внедрить в сельское хозяйство развивающихся стран, где высока стоимость удобрений.

Выращивание бобовых с применением метода инокуляции семян нередко благоприятно сказывается на состоянии окружающей среды: оно помогает бороться с наступающей пустыней, облегчает борьбу с эрозией почв, уменьшает перенос почвы ветром и позволяет с большим успехом восстанавливать истощенные земли. Большинство образующих клубеньки бобовых способны полностью удовлетворить свои потребности в азоте. Однако это бывает только тогда, когда и прочие условия благоприятствуют росту растений, т.е. растения получают достаточно воды и других питательных веществ.

Наиболее простой способ инокуляции основан на использовании почвы, взятой с полей, где выбранная для выращивания культура бобовых растет хорошо. Этот способ широко применялся еще в конце ХIХ века. Недостаток его заключался в том, что при этом приходится перемещать много почвы, так как Rhizobium составляют лишь малую часть микрофлоры и ничтожную часть самой почвы. В Америке обычно вносили 100-1000 кг почвы на 1 га. Брали эту почву с расположенного неподалеку поля, где был получен хороший урожай нужной бобовой культуры. Еще один недостаток этого метода – возможность распространения с почвой болезней растений.

Гораздо меньше почвы необходимо вносить при помощи сеялок, когда бактерии попадают прямо к семенам, где они нужнее всего. На основе этого простого способа был разработан метод прямой инокуляции семян. Сначала применяли измельченную почву (всего примерно 0,5 кг почвы на 1 кг семян), а затем стали использовать методы, основанные на введении чистых культур бактерий.

Первая разновидность коммерческой культуры для инокуляции была запатентована в 1896г. Она поступала на рынок под названием «Nitragin». Для разных бобовых выпускалось 17 ее вариантов. Уже в 20-х гг. ХХ века на рынок поступало много других разновидностей инокулятов. Некоторые из них представляли собой чистые культуры бактерий, смешанные с почвой, песком, торфом, навозом или измельченной породой, другие – культуры, выращенные на агаре или в жидкой среде.

Суть метода инокуляции семян заключается в том, что на семена наносят большое число клеток Rhizobium, соответствующих определенному виду растения-хозяина, что увеличивает вероятность быстрого образования клубеньков у проростков при участии данных микроорганизмов. Для этого нужно достаточно много бактерий, которые должны сохранять жизнеспособность до тех пор, пока в почве они не проникнут в корневые волоски. Для прямой инокуляции семян пригодны культуры Rhizobium, выращенные в пробирках или колбах на среде с агаром.

Rhizobium, выращенные на агаре или в жидкой среде, после высушивания на поверхности семян быстро погибают, да и сами культуры их нежизнестойки. Этих недостатков лишены инокуляты на торфяной основе, которые были созданы в США, и сейчас применяются повсеместно.

При получении культуры нужного штамма Rhizobium выращивают обычным способом в ферментере объемом несколько литров в жидкой среде. К моменту смешивания с торфом (носителем) – плотность культуры должна быть достаточно высокой, 5·10⁸-10⁹ клеток/мл. В случае медленно растущих штаммов, со средним временем удвоения числа клеток около 10 часов, обычно бывает сложно получить культуру с высокой плотностью, и нередко даже размножение более быстро растущих штаммов подавляется видами-загрязнителями. Для обеспечения быстрого роста культуры на жидкой среде полезно вносить сразу много бактерий.

При приготовлении носителя для Rhizobium торф высушивают либо при обычной температуре, либо при осторожном нагревании до влажности ~10%, затем измельчают при помощи мельницы и доводят до рН 6,5-7, добавляя СаСО₃. Рост и выживание бактерий в торфе зависят от многих факторов. Поэтому на каждой партии торфа для получения инокулятов проводят пробные выращивания именно тех штаммов, которые предполагается использовать.

Твердый инокулят состоит из бактерий и носителя, роль которых заключается в поддержании жизнеспособности клеток, поскольку он частично защищает их от пересыхания. Кроме того, носитель способствует более равномерному распределению бактерий в массе семян и помогает им прикрепиться к поверхности семян. Хотя в случае бактериальных суспензий нередко получают хорошие результаты, считается, что применение торфа как носителя более эффективно: т.к. при использовании жидких культур или же суспензий клетки Rhizobium после инокуляции и прикрепления их к поверхности семян оказываются практически беззащитными. Поэтому при производстве коммерческих инокулятов вначале чаще всего использовали именно торф. Однако торф есть далеко не везде, а если он имеется, то сказать заранее, пригоден ли он как носитель, невозможно. В связи с этим были предприняты поиски альтернативных носителей с такими же защитными свойствами, как у торфа.

С неодинаковым успехом для этой цели были испробованы всевозможные композиции: разнообразные смеси почвы и торфа, измельченная солома, нильский ил с добавками питательных веществ, кокосовые хлопья, древесный уголь. Сегодня для поддержания жизнеспособности Rhizobium получают носители из самых разнообразных веществ, но лучшим носителем все же является торф. В некоторых регионах, например в развивающихся странах, определенную ценность могут представлять дешевые местные заменители торфа.

Самый простой но наиболее эффективный метод инокуляции – смешивание сухого инокулята и семян перед посевом. При этом к семенам прикрепляется мало бактериальных клеток, большая часть их теряется, и необходимое условие нанесения достаточного числа клеток Rhizobium на семена не выполняется. Поэтому лучше вносить инокулят в виде водной кашицы. Хорошо прилипает к семенам инокулят на торфе, особенно если добавить к нему водорастворимый клей (карбоксиметилцеллюлозу). При этом повышается выживаемость бактерий после высушивания семян.

Симбиотические отношения, приводящие к фиксации азота, - это наиболее эффективный способ биологического образования аммиака, потребляемого сельскохозяйственными культурами. Влияя на них можно достичь значительного прогресса в использовании биологической фиксации азота для производства пищевых продуктов. Для расширения масштабов и эффективности систем фиксации азота необходимо глубже понять генетику бактерий Rhizobium, чтобы не зависеть столь сильно от природных ситем симбиоза, а формировать их с участием любого желаемого вида растений, употребляемых в пищу.