Биологические опасности. Микотоксины.

В ряду так называемых приоритетных загрязнителей одно из ведущих мест принадлежит токсическим метаболитам плесневых грибов – микотоксинам (от греческого mykos –гриб и toxicon - яд). Плесневые токсинобразующие грибы, имеющие огромное видовое разнообразие, практически повсеместно поражают сельскохозяйственные растения при вегетации и могут развиваться на агропродукции при хранении. Попадая в организм животных с кормами, многие микотоксины накапливаются в мышечных тканях и тем самым загрязняют продукцию животноводства. Более того, микотоксины, как правило, сохраняются в продуктах после технологической обработки и консервирования.

В настоящее время известно более 300 видов различных микроскопических грибов, продуцирующих около 500 токсических метаболитов, отличающихся не только высокой токсичностью, но и мутагенными, тератогенными и канцерогенными свойствами.

Среди микотоксинов своими токсическими свойствами и широким распространением выделяются афлатоксины, охратоксины, трихотеценовые микотоксины, зеараленон и патулин, хотя потенциально опасными для человека являются и многие другие микотоксины. Некоторые сведения об основных микотоксинах представлены в табл.14.

Таблица 14. Основные сведения о микотоксинах

Невозможность полного предотвращения поражения сельскохояйственной продукции микроскопическими грибами- продуцентами микотоксинов – заставляет отвести главную роль в профилактике микотоксикозов человека системе контроля за загрязнением пищевых продуктов микотоксинами, а также установлению безопасных их концентраций (табл. 15).

К настоящему времени достигнуты серьезные успехи в установлении химической структуры микотоксинов, изучении их физико-химических свойств, разработке методов анализа и изучении их распространенности. Микотоксины образуются из первичных метаболитов в результате изменения каких-либо физиологических факторов, как, например, содержание питательных веществ, соотношение микроэлементов и других факторов роста. Токсины микроскопических грибов образуются в цепи последовательных ферментных реакций из относительно небольшого числа химически простых промежуточных продуктов основного метаболизма, таких как ацетат, малонат и аминокислоты. Наиболее важными этапами биосинтеза микотоксинов являются реакции конденсации, окислительно-восстановительные, алкилирование и галогенизация, которые приводят к образованию весьма различных по структуре предшественников микотоксинов.

Известно 5 основных путей биосинтеза микотоксинов:

1) поликетидный, характерный для афлатоксинов, охратоксинов, патулина и др.;

2) терпеноидный – для трихотеценовых микотоксинов;

3) через цикл трикарбоновых кислот – для рубратотоксинов;

4) аминокислотный- исходными соединениями являются аминокислоты- эргоалкалоиды, циклопиазоновая кислота и др.;

5) смешанный (сочетание двух и более основных путей) – для производных циклопиазоновой кислоты.

Таблица 15. ПДК микотоксинов в пищевых продуктах

Поликетидный путь является основным для биосинтеза большой группы микотоксинов. Микотоксины, синтезирующиеся этим путем, в зависимости от числа С2-единиц, включенных в молекулу, подразделяются на тетракетиды (патулин), пентакетиды (охратоксин А), гексакетиды, гептакетиды, октакетиды, монокетиды (зеараленон) и декакетиды (афлатоксины). Терпеноидный путь биосинтеза характерен для большой группы трихотеценовых токсинов. Предполагают, что биосинтез трихотеценового ядра идентичен для всех видов Trichothecium и Fusarium. Однако синтез отдельных трихотеценовых микотоксинов обусловлен различиями в процессе гидроксилирования, катализируемом ферментными системами, генетически отличающимися у отдельных видов грибов. Изучение биогенеза микотоксинов- процесс исключительно сложный и трудоемкий. Несмотря на это, изучение закономерностей биосинтеза помимо теоретического имеет большое практическое значение, поскольку служит главным условием изыскания способов предотвращения токсинобразования микроскопическими грибами. Плесневые грибы поражают продукты как растительного, так и животного происхождения на любом этапе их получения, транспортирования и хранения, в производственных и домашних условиях. Несвоевременная уборка урожая или недостаточная сушка его до хранения, хранение и транспортирование продуктов при недостаточной их защите от увлажнения приводят к размножению микромицетов и образованию в пищевых продуктах токсических веществ. Микотоксины могут попадать в организм человека также с мясом и молоком животных, которым скармливали корма, загрязненные плесневыми грибами. Размножаясь на пищевых продуктах, многие плесневые грибы не только загрязняют их токсинами, но и ухудшают органолептические свойства этих продуктов, снижают пищевую ценность, приводят к порче, делают их непригодными для технологической переработки. Использование в животноводстве кормов, пораженных грибами, ведет к гибели или заболеванию скота и птицы. Ежегодный ущерб в мире от развития плесневых грибов на сельскохозяйственных продуктах и промышленном сырье превышает 30 млрд.долл.

Учитывая широкое распространение в мире микотоксинов, в Казахстане осуществляется мониторинг импортных продуктов на загрязненность микотоксинами. Содержание микотоксинов регламентируется ПДК (табл. 15).

Афлатоксин

Афлатоксины представляют один из важнейших опасных групп микотоксинов, обладающие сильными канцерогенными свойствами (Nechaev A.P., 2003). Афлатоксины впервые были выделены в 1961 году из арахисовой муки, контаминированные грибами рода Aspergillus Flavus, который дал название этой группе микотоксинов.

Афлатоксины производятся в первую очередь общими грибами Aspergillus Flavus и близкородственными видами А. parasiticus. Они хорошо определяются: А. Flavus производится только B афлатоксинами, в то время как А. parasiticus производится B и G афлатоксинами. Афлатоксин М1 метаболит афлатоксина В1, которые могут возникнуть в молоке и молочных продуктах от животных, потребляющих корм, загрязненный В афлатоксинами.

Вид Aspergillus, способный производить афлатоксины, который включают А. Flavus, А. А. parasiticus, А.nomius, А.pseudotamarii, А.bombycis, А. ochraceoroseus, А. аustralis. А. Flavus и А. parasiticus отвечают за наибольшую долю афлатоксинов в пищевых продуктах.

Основные физико-химические свойства афлатоксинов представлены в табл. 16

Таблица 16. Физико-химические свойства основные афлотоксинов

Афлатоксины обладают способностью сильно флюоресцировать при воздействии длинноволнового ультрафиолетового излучения, что лежит в основе практически всех физико-химических методов их обнаружения и количественного определения. Эти соединения слабо растворимы в воде (10...20 мкг/л), нерастворимы в неполярных растворителях, но легко растворимы в растворителях средней полярности таких, как хлороформ, метанол и диметилсульфоксид. Они относительно нестабильны в химически чистом виде и чувствительны к действию воздуха и света, особенно ультрафиолетового излучения.

Несмотря на это, следует отметить, что афлатоксины практически не разрушаются в процессе обычной технологической или кулинарной обработки загрязненных пищевых продуктов. Полное разрушение афлатоксинов может быть достигнуто лишь путем их обработки аммиаком или гипохлоритом натрия.

Токсинообразование. A. flavus относится к мезофильным микроскопическим грибам и может развиваться при температуре от 6...8 °С (min) до 40...46 °С (max). Оптимальной для образования токсинов является температура 27...30 °С. Однако в условиях производственного хранения зерна максимальное образование афлатоксинов происходит при 35...45 °С, что значительно превышает температурный оптимум, установленный в лабораторных условиях.

Другим критическим фактором, определяющим рост A. flavus и синтез афлатоксинов, является влажность субстрата и атмосферного воздуха. Максимальный синтез токсинов A.flavus происходит при влажности свыше 18 % для субстратов, богатых крахмалом, - зерна (пшеница, ячмень, рожь, овес, рис, кукуруза, сорго) и свыше 9...10 % для субстратов с высоким содержанием липидов- семена (арахис, подсолнечник, хлопчатник), копра (маслосодержащая часть кокосовых орехов), различные виды орехов при относительной влажности воздуха 97...99 %. При относительной влажности атмосферного воздуха ниже 85 % синтез афлатоксинов прекращается. Условия аэрации также оказывают заметное влияние на рост и токсинообразование A.flavus. Даже незначительное количество кислорода приводит к резкому усилению синтеза афлатоксинов, в то время как добавление в среду углекислого газа ингибирует их образование. Образование афлатоксинов в значительной степени зависит от состава субстрата, на котором развивается гриб. Синтезу афлатоксинов способствуют, например, среды, содержащие в качестве источников углеводов сахарозу, глюкозу, галактозу, сорбозу, рибозу, ксилозу, мальтозу; в меньшей степени- фруктозу и крахмал; токсины не продуцируются на среде с лактозой. Присутствие дрожжевого или кукурузного экстракта вызывает выраженное усиление синтеза афлатоксинов. Наличие карбоновых кислот, таких как себациновая и пальмитиновая, приводит к максимальному образованию афлатоксинов. Уксусная, пропионовая, масляная, капроновая, энантовая, каприловая, пералгоновая, каприновая, глутаровая и линолевая кислоты подавляют образование афлатоксинов. Соотношение между насыщенными и ненасыщенными жирными кислотами существенно влияет на синтез афлатоксинов. Уровень токсинообразования зависит также от концентрации в среде некоторых металлов. Так, цинк в концентрации 10 мкг/мл является эссенциальным элементом для синтеза афлатоксинов. В то же время молибден, ванадий, железо, медь, серебро, кадмий, хром, ртуть и марганец подавляют токсинообразование, а никель, кобальт и свинец на него существенно не влияют. Значительное влияние на рост, развитие и токсинообразование плесеней на природных субстратах может оказывать присутствие на них других видов микроскопических грибов. Например, синтез афлатоксина В1токсигенным штаммом A. parasiticus в присутствии А. niger подавляется на 78 %, а в присутствии F. moniliforme, H. maydis и С. Lunata – на 15...25 %. В то же время Penicillium chrysogenum и Altemaria alternata не влияют на синтез афлатоксинов, а одновременное присутствие A. parasiticus с P. ruhrum приводит к повышенному образованию афлатоксинов. Афлатоксины действуют практически на все компоненты клетки, вызывая заболевания - афлатоксикозы.

Методы определения афлотоксинов:

1. Хроматографические методы (ВЭЖХ, ТСХ). Достоинства: высокая чувствительность и точность. Недостаток: длительность, трудоемкость и дороговизна.

2. Иммуноферментные методы (прямые и непрямые). Достоинства: высокая производительность, простота. Недостаток: относительно невысокая точность.

Предельно допустимая концентрация афлатоксина В1 в пищевых продуктах, кроме молока, составляют не более 0,005 мкг/кг. Для молока и молочных продуктов - 0,001 мг/кг (для афлатоксина М1- 0,05 мкг/кг). В продуктах детского и профилактического питания афлатоксины не допускаются. Допустимая суточная доза (ДСД) - 0,005...0,01 мкг/кгмассы тела.

Трихотецены

В настоящее время известно более 40трихотеценовых микотоксинов (ТТМТ). В зависимости от структуры трихотеценового ядра ТТМТ делят на 4 группы: А, В, С, D. ТТМТ представляют собой бесцветные кристаллические химически стабильные соединения, плохо растворимые в воде. Микотоксины типа А растворимы в умеренно полярных растворителях (ацетон, этилацетат, хлороформ); типа В - в более полярных растворителях (метанол, этанол). В целом ТТМТ типа А более токсичны, чем типа В, а соединения, относящиеся к типу Д, несмотря на наличие двух эпоксидных групп, малотоксичны. Основные физико-химические свойства некоторых ТТМТ приведены в табл. 17.

Таблица 17. Основные физико-химические свойства некоторых трихотеценовых микотоксинов

В системе хлороформ-ацетон 3:2

Эти токсины не обладают флюоресценцией, и для их обнаружения после разделения методом ТСХ применяют различные способы обработки с целью получения окрашенных или флюоресцирующих производных. Так, при обработке хроматографических пластин 10 % спиртовым раствором хлорида алюминия и после нагревания при 90±1 °С дезоксиниваленол флюоресцирует голубым цветом. Микроскопические грибы, продуцирующие ТТМТ, широко распространены в природе и представлены как строго сапрофитными (Stachybotrys alternans), так и фитопатогенными (Trichoderma roseum, Myrothecium verrucaria) видами. Различные виды Fusarium, к которым относится большинство продуцентов этих токсинов, отличаются выраженной способностью приспосабливаться к изменяющимся условиям существования, что обусловливает возможность перехода их от сапрофитной стадии роста к паразитированию на тканях высших растений, ослабленных вследствие воздействия каких-либо неблагоприятных факторов окружающей среды. Основные продуценты Т-2 токсина были выделены из кормов и продовольственного сырья, явившихся причиной алиментарных токсикозов у сельскохозяйственных животных и людей. К ним относятся: F. poae, F. acimination, F. sporotrichioides, F.sulphureum, F. oxy-sporum, F. tricinctum и F. solani.

Дезоксиниваленол (вомитоксин) продуцируется главным образом различными штаммами F. graminearum, F. culmorum, F. nivale.

Токсинообразование. Грибы рода Fusarium в естественных условиях интенсивно накапливают токсины при повышенной влажности и пониженной температуре. В лабораторных условиях при культивировании токсичных штаммов Fusarium на зерновом субстрате максимальное образование Т-2 токсина наблюдалось через 4...6 недель при 8...12 °С. Характерной особенностью является усиление синтеза токсинов при попеременном изменении температуры инкубации. Например, предварительное воздействие на культуры F. sporotrichiella повышенными температурами (до 50 °С) или низкими приводило к усилению токсинообразования в 2...4 раза. Максимальный синтез Т-2-токсина наблюдается при 8...14 °С, при 24 °С и выше, этот процесс значительно тормозится. Температурный оптимум развития дезоксиниваленола (вомитоксина) значительно выше: 24...27 °С в культуре F. nivale. Интересно, что попеременное культивирование F. nivale при оптимальной и низкой температурах не стимулировало синтез токсина. Синтез дезоксиниваленола F. graminearum достигал максимума на 40-й день культивирования при 28°С, a F. roseum – на 41-й день при 26 °С. Снижение температуры инкубации до 19,5 °С почти полностью подавляло этот процесс. На токсинообразование влияет химический состав среды культивирования.

В культуре F. sporotrichiella максимальный синтез токсинов наблюдается при использовании в качестве источника углерода целлобиозы, галактозы, мальтозы, маннита и крахмала, а в качестве источника азота- мочевины, углекислого ацетата и цитрата аммония, а также некоторых аминокислот (аланина, глицина, валина, тирозина и глутаминовой кислоты). Некоторые минеральные вещества существенно влияют на синтез токсинов F. sporotri-chiella: избыток серы и железа стимулирует его, недостаток в среде серы подавляет; цинк, ванадий и магний стимулируют, а кобальт полностью подавляет рост мицелия. В настоящее время у нас в стране и зарубежом отмечается увеличение заболевания посевов пшеницы, ячменя и других колосовых культур фузариозом. Заболеванию способствуют дождливое лето, высокая температура и высокая относительная влажность воздуха. Различают две формы фузариоза. При раннем фузариозе зерно повреждается в фазу молочной спелости. Потери урожая составляют 30...50 %. Зерно белесоватое, щуплое, морщинистое, легковесное, с хрупким меловидным эндоспермом, легко разламывается пальцами. При этом наблюдается полная потеря стекловидности, зародыш нежизнеспособный, его срез темного цвета. При позднем фузариозе зерна по размерам и форме не отличаются от здоровых. Эти зерна остаются в партии товарного зерна и представляют наибольшую опасность. При обеих формах фузариоза на поверхности зерен под лупой обнаруживается мицелий гриба в области зародыша и бороздки.

В комбикормах, кормосмесях, рационах для всех видов животных допускается содержание вомитоксина не более 1 мкг/кг. На продовольственные цели без ограничения можно принимать партии зерна пшеницы с содержанием фузариозных зерен до 1 %. В соответствии с установленными Министерством здравоохранения РК нормами принятое зерно пшеницы может быть использовано на продовольственные цели при содержании вомитоксина не более 1мг/кг в сильной и твердой пшенице и до 0,5мг/кг в мягкой пшенице. На кормовые цели зерно может быть использовано при концентрациях вомитоксина не более 2 мг/кг. Допустимые уровни Т-2 токсина не должны превышать 0,1 мг/кг.

Зеараленон

Микроскопические грибы рода Fusarium помимо ТТМТ могут продуцировать и другие микотоксины, среди которых наибольшее практическое значение имеет зеараленон. По своей структуре зеараленон является лактоном резорциловой кислоты. Природный зеараленон имеет трансконфигурацию. Он представляет собой белое кристаллическое вещество, плохо растворимое в воде и n-гексане, хорошо растворимое в этаноле, метаноле, ацетонитриле, ацетоне и бензоле. Зеараленон обладает сине-зеленой флюоресценцией в ультрафиолетовом свете при 360 нм.

Токсинообразование. Основным продуцентом зеараленона является F. graminearum, но в лабораторных условиях способность синтезировать этот микотоксин обнаружена у F. moniliforme и F. tricinctum. Максимальное токсинообразование наблюдается при культивировании F. graminearum на зерновых субстратах рис, пшеница, кукуруза). При этом инкубация проводится в два этапа: сначала две недели при 22...25 °С, а затем 8 недель при 15 °С. При влажности субстрата ниже 25 % токсинообразование резко снижается. При одновременном культивировании F. graminearum с другими грибами (A.flavus, A. niger, A. ruber и различными видами Penicillium) токсинообразующая способность подавляется. Зеараленон часто обнаруживается вместе с другими микотоксинами, включая афлатоксины, охратоксины, токсин Т-2 и другие трихотеценовые токсины. Установлено, что зеараленон обнаруживается в зерне, в частности, в кукурузе, пшенице, ячмене, овсе, сорго, кунжуте, а также кукурузном силосе, масле, крахмале, если они произведены из кукурузы, содержащей микотоксин.

Токсичность зеараленона заключается в развитии тяжелого гиперэстрогенизма у домашнего скота и мутагенном действии на организм человека. Предельно допустимая концентрация зеараленона в зерне, зерновых продуктах, орехах, семенах масличных растений, жирах, маслах, белковых изолятах- 1 мг/кг; в продуктах детского и диетического питания его присутствие не допускается.

Патулин

Патулин был впервые выделен в 1943 г. из культуры Penicillium patulum как антибиотик. Обнаружение у патулина высокой токсичности, мутагенных и канцерогенных свойств, а также выявление его в качестве загрязнителя пищевых продуктов заставляет отнести патулин к особо опасным микотоксинам. По химической структуре патулин представляет собой 4-гидро-ксифуропиран. Продуцентами патулина являются различные виды Penicillium -P. expansion, P. claviforme, P.urticae (P. patulum), P. cyclopium, P. viri-dicatum, P. roqueforti; и Aspergillus - A. clavatus, A. terreus, A.giganyeus; а также Bys-sochlamys fulva и В. nivea. Продуценты патулина поражают преимущественно фрукты и некоторые овощи. Токсин обнаруживается в яблоках, грушах, абрикосах, персиках, черешне, винограде, бананах, клубнике, томатах, а также фруктовых соках, компотах, пюре и джемах. Чаще, чем другие плоды, патулином загрязняются яблоки. Следует подчеркнуть, что патулин концентрируется в основном в подгнившей части яблока, в то время как в неповрежденной части определяется только около 1 % общего количества токсинов. Однако в томатах независимо от размеров подгнившего участка патулин распределяется равномерно по всей ткани. Экспериментально доказано, что цитрусовые и некоторые овощные культуры (картофель, лук, редис, редька, баклажаны, цветная капуста, тыква и хрен) обладают естественной резистентностью к заражению продуцентами патулина. Максимальное токсинообразование наблюдается обычно при температуре 21...30 °С. Патулин оказывает мутагенное действие на организм человека и животного- изменение генетической информации, тератогенное действие, приводящее к появлению уродств и отклонениям в развитии молодого организма, и некротическое действие, вызывающее гибель клеток. Предельно допустимая концентрация патулина, по медико-биологическим требованиям, предъявляемым к фруктовым и овощным сокам, пюре, составляет не более 0,05 мг/кг; в продуктах детского и диетического питания присутствие следов патулина не допускается.

В настоящее время усилен контроль за загрязнением пищевых продуктов данными микотоксинами во многих странах мира. В соответствии с рекомендациями ВОЗ, ФАО и ЮНЕП, накопленным международным опытом создана многоступенчатая система контроля. Допустимые уровни содержания микотоксинов в отдельных группах пищевых продуктов приведены в табл. 3.6.

Таблица 18. Допустимые уровни содержания микотоксинов в отдельных группах пищевых продуктов