Суспензионные культуры

Суспензионные культуры – это одиночные клетки, мелкие, средние и крупные агрегаты (группы клеток), выращиваемые в жидкой питательной среде при постоянной аэрации (доступ кислорода) в асептических условиях. Суспензии получают из каллусов. Для инициации суспензионной культуры необходимо 2-3 г свежей рыхлой массы каллусных клеток на 60-100 мл жидкой питательной среды. Первичную суспензию культивируют в колбах с жидкой питательной средой на круговых качалках со скоростью 100-120 об./мин.

Суспензионные культуры широко используются в качестве модельных систем для изучения путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов, деградации чужеродных соединений, цитологических исследований и др.

Модельная кривая роста суспензии имеет S-образную форму и включает: лаг-фазу, экспоненциальную фазу, стационарную фазу и фазу деградации. Форма реальных ростовых кривых отличается продолжительностью фаз. Это зависит от генетики популяции, количества инокулюма и состава питательной среды. Скорость нарастания биомассы колеблется от 15 до 70 суток.

Суспензии используют для получения важных химических веществ: органических кислот, ферментов, алкалоидов, красителей, белков, аминокислот, которые применяются в фармакологии, парфюмерии, пищевой и химической промышленности, сельском хозяйстве.

Суспензионные культуры имеют большое значение для генетики и особенно молекулярной биологии: из суспензионных клеток получают протопласты, необходимые для соматической гибридизации, генетической инженерии, а также для изучения метаболизма клеток.

Культивирование растительных клеток в жидкой питательной среде при постоянном перемешивании лишено многих недостатков, свойственных культивированию каллусных клеток на агаризованных твердых средах. Постоянное движение растительных клеток в жидкой среде облегчает газовый обмен, решает проблемы питательного градиента и полярности роста клеток. Большинство суспензионных культур можно получить путем переноса кусочков рыхлого каллуса в перемешиваемую жидкую среду того же состава, что и среда, на которой выращивался каллус. Для каждой линии суспензионной культуры клеток существует минимальный размер инокулюма (числа пересеваемых клеток), при меньшем размере которого суспензионная культура клеток не растет. С уменьшением размера инокулюма увеличивается длина лаг-фазы. Суспензионные культуры клеток растений широко используются в качестве модельных систем для изучения путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов, а также как исходный материал для выделения ферментов. Важным их преимуществом при выделении ферментов или продуктов вторичного метаболизма является отсутствие у большинства суспензионных культур клеток хлорофилла и каротиноидных пигментов. В связи с тем, что суспензионные культуры клеток, в основном, состоят из относительно гомогенной популяции клеток, которые можно быстро обрабатывать с помощью добавляемых в среду культивирования химических веществ, они очень удобны для биохимических экспериментов, проводимых при исследовании метаболизма уводимых веществ, а также для выделения и характеристики мутантов.

Микрочеренкование.

Микроклональное размножение пробирочных растений осуществляют с помощью черенкования. Такое размножение основано на подавлении апикального доминирования и активации пазушных меристем при удалении верхушки побега. Из пазушных почек на питательных средах образуются побеги. Растения, сформировавшие 5-6 листочков, в стерильных условиях извлекают из пробирок и разрезают на части (отрезок стебля с листом и пазушной почкой). Черенки высаживают на глубину междоузлия в питательные среды либо без гормонов, либо с добавлением ауксинов.

Черенки культивируют в тех же условиях, что и меристемы: при температуре 24-25^оС днем и 19-20^оС ночью, освещенности 5-6 кLx и продолжительности фотопериода 16 часов.

Рост стебля и корней начинается на 3-4 день после посадки на питательную среду, а полностью растения формируются через 12-15 дней.

Каждое последующее черенкование проводят через 14-20 дней. Из одного растения можно получить 5-8 черенков, а через 2-3 месяца – 3-5 тыс. черенков.

Нижнюю часть растения используют для ИФА. Растения, зараженные вирусами, бракуют, а здоровые дают начало мериклонам (меристематическим клонам).

Если почки или черенки высадить на питательные среды с высоким содержанием цитокининов, то образуется конгломерат почек и побегов. Полученные побеги легко отделяются друг от друга, их можно либо укоренить, либо использовать для дальнейшего микрочеренкования.

Для укоренения растений, образовавшихся при микрочеренковании, их необходимо пересадить на новую питательную среду. Черенки и побеги легко укореняются на средах с обедненным составом минеральных солей (среда Уайта, Мурасиге-Скуга, разбавленная вдвое), либо на средах с добавлением ауксинов: ИУК, НУК, ИМК.

Проростки, сформировавшиеся в пробирках со средами, можно рассматривать как небольшие укорененные растения, которые необходимо адаптировать к обычным условиям выращивания. Такие растения лучше пересаживать в грунт, когда полностью сформируются 5-6 листьев и достаточно разрастутся корни. Однако, разные виды культурных растений по-разному приспосабливаются к изменению условий среды. Каждое растение требует специально подобранных условий культивирования в грунте, которые устанавливают экспериментально.

Тема: «Лабораторная работа № 6

Тема: «микрочеренкование стерильных проростков»

Материалы и оборудование. Растения примулы, 6% раствор гипохлорита натрия, колбы со стерильной дистиллированной водой, колбы со стерильной питательной средой для индукций каллусогенеза.

Ход работы.

1. Листья примулы поместить в стерилизующий раствор на 5 минут, затем промыть стерильной дистиллированной водой 3 раза.

2. Стерильным скальпелем вырезать срединную жилку листа с участком паренхимы: длиною 1,5-2 см, шириной 1 см.

3. Поместить экспланты на питательные среды (перед каждой манипуляцией инструменты обрабатывать спиртом и обжигать на пламени спиртовки).

4. Колбы с эксплантами перенести на стеллажи для индукций каллусогенеза при температуре 18 + 2^о С.

5. Результаты зарисовать через 2-4 недели.

«Лабораторная работа № 7

Тема: «индукция органогенеза и соматического

эмбриогенеза в каллусной ткани табака под действием фитогормонов»

Материалы и оборудование. Пробирки с каллусами примулы, колбы на 50 мл со стерильном питательной средой (МС без гормонов), колбы со средами для стеблевого органогенеза и соматического эмбриогенеза и индукции ризогенеза, флаконы с 96 % спиртом, стерильные пинцеты и препарировальные иглы, спиртовка, ламинар-бокс.

Ход работы.

1. Стерильным пинцетом переложить каллусы на стерильную поверхность стола ламинар-бокса, разделить на кусочки 5х5 мм. и поместить в колбы с питательными средами, содержащими различные наборы фитогормонов.

2. Колбы перенести в культуральную комнату с температурой 18 + 2^оС, влажностью воздуха 70 % и интенсивностью освещения 5кLх.

3. Результаты эксперимента зарисовать через 2-4-6-8 недель.

Контрольные вопросы к теме

1. Что такое микроклональное размножение растений: основные этапы?

2. Каковы основные способы микроклонального размножения?

3. Чем отличаются питательные среды для пролиферации побегов, индукции корнеобразования, культивирования меристем, получения микроклубней?

5. Для каких целей используют культуру каллусов в биотехнологии, генетике и селекции?

ТЕРМИНОЛОГИЯ

In vitro – выращивание растительных объектов «в стекле» (пробирке, колбе, биореакторе) на искусственных питательных средах, в асептических условиях.

Тотипотентность – свойство соматических клеток полностью реализовать генетический потенциал целого организма.

Омнипотентность ядер – сохранение ядрами соматических клеток растений всех потенций ядра зиготы, то есть сохранение всей генетической информации.

Культура тканей in vitro – выращивание в длительной пересадочной культуре тканей, возникших путем пролиферации клеток изолированных сегментов разных органов или самих органов растений.

Культура органов in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде в пересадочном режиме изолированных корней, стеблевых апексов, незрелых частей цветка, незрелых плодов.

Культура корней in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде в пересадочном режиме изолированных корней.

Культура меристем in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде изолированного апекса или пазушной почки побега конуса нарастания с одним или двумя листовыми примордиями.

Культура суспензионная или культура клеток in vitro – асептическое выращивание отдельных клеток или их небольших групп во взвешенном состоянии в жидкой питательной среде.

Культура зиготических зародышей in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде незрелых или зрелых изолированных зародышей.

Апекс – верхушечная часть стебля или корня.

Меристема – образовательная ткань с мелкими, активно делящимися клетками.

Апикальное доминирование – явление подавления роста боковых почек побега в присутствии терминальной почки.

Адвентивные почки – почки, возникшие из тканей и клеток растения, обычно их не образующих.

Фитогормоны – (гормоны растений) – биолигически активные соединения, образующиеся в раститениях в малых количествах, вызывающие специфический ростовой или формообразовательный эффект.

Ауксины – фитогормоны (ИУК, НУК, 2,4-Д), активизирующие рост стеблей и корней, стимулирующие образование корней у проростков.

Цитокинины – фитогормоны (кинетин, 6-БАП), активизирующие развитие меристем, стимулирующие образование почек.

Гиббереллины – фитогормоны (ГК и др.), активизирующие рост стеблей, вызывающие прорастание семян.

ГК – гибберелловая кислота

ИУК – -индолилуксусная кислота

НУК – -нафтилуксусная кислота

2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота

6-БАП – 6-бензиламинопурин

Клональное микроразмножение или микроклональное размножение – получение in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному (метод вегетативного размножения растений в культуре in vitro).

Эксплант фрагмент ткани или органа, инкубируемый на питательной среде самостоятельно или используемый для получения первичного каллуса.

Пролиферация – новообразование клеток и тканей путем размножения уже существующих.

Дедифференциация – переход специализированных клеток к пролифирации и неорганизованному каллусному росту (утрата клетками специализации).

Редифференциация – переход специализированных клеток из одного состояния дифференцировки в другое с предшествующими делениями или непосредственно.

Дифференциация – комплекс процессов, приводящих к различиям между клетками.

Дифференцировка – состояние специализации клеток, отличающее их от других.

Морфогенез in vitro – процесс формообразования, то есть заложения, роста и развития клеток (цитогенез), тканей (гистогенез) и органов (органогенез) в культуре клеток и тканей in vitro.

Ризогенез – процесс заложения, роста и развития корней.

Регенерация – восстановление целостного организма из клетки, ткани, органа.

Эмбриоидогенез – процесс образования зародышеподобных структур (эмбриоидов) неполовым путем в культуре тканей и клеток in vitro.

Каллус – группа дедифференцированных клеток, возникших in vivo или in vitro путем неорганизованной пролиферации.

Культура каллусов in vitro – выращивание в длительной пересадочной культуре каллусов, возникших путем дедифференциации и пролиферации клеток, тканей, органов растений.

Культура «привыкших» тканей – выращивание тканей, возникших путем редифференциации или мутации клеток нормальных каллусных тканей, и способных расти на питательных средах без гормонов.

Трансплант – часть каллусной ткани, используемая для переноса на свежую питательную среду.

Инокулюм – часть клеточной суспензии, используемая для переноса на свежую питательную среду.

Субкультивирование – процесс переноса транспланта или инокулюма в культуральный сосуд на свежую питательную среду.

Цикл выращивания – период от помещения клеточного инокулюма или каллусного транспланта на питательную среду до последующего субкультивирования.

Ростовой цикл – рост популяции клеток в цикле периодического выращивания, характеризующийся сигмоидальной (S-образной) кривой. Фазы ростового цикла: латентная (лаг-фаза), экспоненциальная (лог-фаза, фаза логарифмического роста), замедления роста, стационарная, деградации.

Штамм – культура, возникшая после первого субкультивирования, и состоящая из многих клеточных линий, возникших из клеток первичного каллуса.

Линия – культура, возникшая из штамма путем селекции или клонирования, имеющая маркерные признаки.

Клон – культура, возникшая из одной клетки.

Клеточная селекция in vitro – метод выделения мутантных клеток и сомаклональных вариаций с помощью селективных условий.

Сомаклональные вариации и варианты – фенотипическое выражение непостоянства ядерного и органелльных цитоплазматических геномов культивируемых клеток. От истинных генных мутаций отличаются большей частотой возникновения и комплексностью изменений (изменения в структуре генов, хромосом, геномов).

Эпигенетические вариации – фенотипическое выражение дифференциальной активности генов. От мутаций и сомаклональных вариаций отличаются тем, что не сохраняются в цикле клетка-растение-клетка.

Соматическая (парасексуальная) гибридизация – способ создания гибридных клеточных линий и соматических гибридов растений путем генетической рекомбинации хромосом и генов ядра и органелл вне сексуального цикла, например путем слияния изолированных протопластов.

Изолированный протопласт – растительная клетка, лишенная клеточной стенки с помощью ферментативного или механического разрушения.

Цитопласт – ограниченный мембраной участок цитоплазмы, возникший при фрагментации изолированного протопласта.

Субпротопласт – изолированный протопласт, потерявший часть цитоплазмы, сохранивший ядро.

Слияние изолированных протопластов – формирование одной клетки из двух и более объединением их поверхностных мембран.

Культура изолированных протопластов – выращивание клеток, лишенных стенок, в жидкой или на агаризованной среде, содержащей в качестве дополнительного компонента осмотически активное вещество (стабилизатор) в оптимальной для данного вида концентрации. При регенерации стенок изолированные протопласты превращаются в культуру клеток.

Соматический гибрид – растение, полученное путем гибридизации изолированных протопластов.

Цибрид – растение, полученное при слиянии изолированного протопласта с цитопластом, протопластом с инактивированным ядром или с энуклеированным протопластом.

Кариотип – набор хромосом, характерных для данного вида.

Моноплоид – ядро, клетка, организм, характеризующиеся основным чис-лом хромосом в полиплоидной серии (символ Х).

Гаплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся набором хромосом, представляющим половину полного набора, свойственного виду

(символ n).

Диплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся двойным набором гомологичных хромосом, представленным числом, характерным для данного вида (символ 2n).

Псевдодиплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся диплоидным числом хромосом, отличающиеся от зигот данного вида по кариотипу.

Полиплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся умноженным основным числом хромосом (символ 3Х, 4Х и т.д.).

Эуплоид – ядро, клетки, организм с числом хромосом, кратным Х.

Анеуплоид – ядро, клетки, организм с числом хромосом, отклоняющимся от Х и от чисел, кратных Х.

Мутация – изменения в генетическом материале клеток путем перестройки ДНК ядер и органелл, изменений в структуре хромосом или уровне плоидности организма.

Рецессив – ген или генетически обусловленный признак, проявляющийся в диплоидной клетке или организме при условии, когда оба набора хромосом несут данные гены.

Доминант – ген, проявляющийся как признак при условии, когда гомологичные наборы имеют разные гены.