Получение микрочеренков.

Использование микрочеренков при клональном размножении растений in vitro имеет наиболее широкое распространение. В качестве черенков чаще всего используются просыпающиеся почки или верхушки молодых побегов. У корневищных многолетников (хосты, ветреницы, астильбы, акониты и др.) используют подземные почки корневища. У луковичных листовые чешуи (лилии) или центральные почки (нарциссы, тюльпаны) луковиц. В некоторых случаях используются листовые черенки – растения способные продуцировать особи из фрагментов листьев или их черешков (сенполии, стрептокарпусы, бегонии королевские, сансивьеры и др.). При этом главным является отбор черенков на начальных этапах сезонного роста. В этот период их инфицирование значительно меньше и повышенный гормональный фон способствует более эффективному введению.

При введении таких черенков in vitro используется этапная стерилизация исходного материала с использованием спирта, перекиси водорода и хлорсодержащих препаратов. При удачном введении в последствии дальнейшее их клонирование осуществляется с использованием микрочеренков, которые представляют собой нарезанные фрагменты побегов с 1-3 узлами, или отделенные пучки мелких побегов, обильно нарастающих в базальной части. Этот же способ размножения может быть использован и с растениями стерильными после развития растений из калюсных культур. Микрочеренки отделяются от материнского клона и рассаживаются в новые колбы с агаризованной средой. При достижении ими «товарных» размеров их высаживают на среду с повышенным фоном ауксинов (0,5-3,0 мг/л) для окончательного укоренения. После чего растения готовы к высадке из колб на почвенный субстрат и адаптации к нестерильным условиям. Этот способ значительно сокращает сроки процесса размножения (минуя стадии калюсообразования), однако при этом не происходит очищение материала от вирусов.

Этот способ размножения основан на формирование адвентивных почек и побегов. Способность к индукции адвентивных почек в обычных условиях встречается у некоторых видов растений (например, в роде бегония). Такая индукция в значительной степени определяется содержанием гормонов в среде или регулярным механическим повреждением верхушечной почки механически (срезкой верхушек). Результат - снятие апикального доминирования и закладка адвентивных почек. Этот метод уже стал промышленным при производстве посадочного материала некоторых культур. Эта модель наиболее детально была отработана на картофеле.

При работе с картофелем чаще всего пользуются черенкованием. Для этого выросший в пробирке из меристемы побег расчленяют с соблюдением стерильности на фрагменты размером 0,5-1,0 см, каждый из которых должен иметь листочек и пазушную почку.

Эти черенки сразу же помещают на питательную среду того же состава для доращивания и укоренения. При этом среда может быть как плотной (т.е. с агаром), так и жидкой. Как только высаженные черепки сформируют из пазушной почки новый побег, последний вновь черенкуют.

Таким образом, из ограниченного числа «меристемных» растений за несколько месяцев можно получить большое количество безвирусного посадочного материала (за полгода- 30000). При этом за каждый цикл черенкования оно возрастает и 4-5 раз. По мнению многих исследователей, способы размножения на основе снятия апикального доминирования имеют минимальную степень риска в отношении получения неоднородного потомства. Частота появления мутантных форм (в расчете на число новообразований) здесь не превышает частоту появления таковых при размножении растения обычными методами. Данный способ получает все большее распространение в практике. Он универсален и отличается относительно высокой воспроизводимостью полученных результатов.

4.4. Стерилизация эксплантов и введение в «in vitro»

С целью получения эксплантов для каллусной и опухолевой культур, микроклонального размножения, изучения гормональной регуляции используют стерильные проростки. Семена для проращивания высевают либо на воду, либо на питательную среду.

Растительные объекты перед стерилизацией тщательно отмывают проточной водой, иногда с моющими средствами, очищают от излишних тканей. С корнеплодов и корней снимают кожуру, с побегов – кору, с почек – кроющие чешуи.

Растительные экспланты стерилизуют растворами веществ, содержащими активный хлор (хлорамином, гипохлоритом Nа), бром (бромной водой), tween-20, перекисью водорода, спиртом, нитратом серебра, диацидом, антибиотиками. Следует подбирать такие концентрации стерилизующих агентов, которые не повреждали бы сами семена, не угнетали их всхожесть и обеспечивали максимальную стерильность.

Этиловый спирт часто применяют для предварительной стерилизации, протирая им поверхность материала или погружая материал на несколько секунд в абсолютный спирт. Иногда такой стерилизации достаточно, ее используют при работе с плодами, семенами, побегами, завязями.

Гипохлорит кальция (хлорная известь) используется в виде 5-7 % раствора для обработки почек, завязей, цветков, семян, побегов в течение 5-8 минут.

Гипохлорит натрия используется в виде 0,5-5 % раствора для обработки любых эксплантов в течение 1-20 минут. Это вещество является клеточным ядом, поэтому время стерилизации и концентрацию подбирают экспериментально. Например: для изолированных зародышей используют 2-3 % раствор в течение 10-15 минут, а для сухих семян 3-5 % раствор в течение 1 часа. Остатки гипохлорита натрия сначала удаляют 0,01 н HCl, а затем 8 раз промывают автоклавированной дистиллированной водой.

Хлорамин применяют в концентрации 1-6 %. Пыльники и молодые зародыши обрабатывают в течение 1-3 минут, сухие семена – 30-60 минут, затем промывают стерильной дистиллированной водой 2-3 раза.

Сулема – токсичное вещество и требует особой тщательности, как при хранении, так и при подборе концентрации для отдельных объектов. Для стерилизации зародышей используют 0,1 % раствор в течение 1-3 минут, для корне- и клубнеплодов – до 10-20 минут.

Растворы, содержащие активный хлор используются 1 раз и готовят их непосредственно перед работой.

Диацид используется в 0,2 % растворе для стерилизации корнеплодов, семян, кусочков, тканей, верхушечных меристем, изолированных зародышей, пыльников. Диацид готовят, растворяя отдельно 330 мг этанолмеркурхлорида и 660 мг цетилпиридиния хлорида в горячей воде (330 мл), затем их смешивают и доводят объем жидкости до 1 л, добавляют несколько капель детергента твин-80; хранят в плотно закрытой колбе в темноте.

Антибиотики применяют для стерилизации растительного материала, инфицированного бактериями (ткани корончатогалловых опухолей). Наиболее часто применяют стрептомицин и тетрамицин 10-80 мг/л, ампициллин 200-400 мг/л, левомицитин, каномицин и другие.

В качестве стерилизующего агента применяют также перекись водорода, которая менее всего повреждает экспланты и после которой не требуется отмывка в стерильной воде, так как она быстро разлагается.

Стерилизацию эксплантов необходимо проводить в стерильных (асептических) условиях: в ламинар-боксе.

Колбы с эксплантами после помещаются в абсолютную темноту при комнатной температуре на неделю для выявления степени стерильности. Те колбы, в которых началось заражение, следует сразу удалять.