А. Измерение кинетики затухания замедленной флуоресценции

Кинетика затухания флуоресценции растений после короткого (порядка 1 с) импульса

света, включает в себя короткоживущие (тау= 10в-9 – 10в-7 с, быстрая флуоресценция) и

долгоживущие компоненты (тау= 10в -6 - 10 с, замедленная флуоресценция). Спектральный состав всех компонент флуоресценции одинаков, поэтому выделить

послесвечение можно только по времени. Для этого момент возбуждения отделяется от

начала регистрации свечения некоторым темновым интервалом, в течение которого быстрая флуоресценция хлорофилла полностью затухает. В установке объект закрепляется в камере под фотоэлектронным умножителем (ФЭУ), регистрирующем слабое свечение. На момент освещения ФЭУ закрывается шторкой, на нижней поверхности которой расположен светодиод. После окончания освещения (1 с) шторка автоматически открывает ФЭУ, причем за время открывания шторки быстрая

флуоресценция полностью затухает. После этого компьютер регистрирует кинетику

затухания замедленной. Анализ кривых затухания (разложение кривых на сумму нескольких экспонент) позволяет оценить количество компонент послесвечения (n) и их характерные времена жизни (тауn). Этот метод регистрации секундных компонент послесвечения часто используют для оценки функционального состояния водоразлагающего комплекса и первичного донора Z. На праке на компьютер выдал графики зависимости А1 и А2 от I, где А=А0*exp(-t/тау) – уравнение экспоненты, на которые мы раскладываем, а еще мы получили графики зависимости тау1 и тау2 от I. А потом еще и диуроном обработали. При диуроне А1 резко увеличилась, а А2 осталась той же, т.к. диурон их разобщает. Тау с увеличением интенсивности убывает во всех случаях, но с диуроном их значения меньше. А еще мы построили графики зависимости I от времени t (затухающая экспонента). С диуроном ее начальный пик был в несколько раз больше, т.к. блокируется переход 5 на рисунке 2, и большее количество энергии уходит в виде флуоресценции (с этим же можно связать увеличение А1). Блок-схема установки для регистрации короткоживущих компонент свечения представлена на рис. 5.

Внешний и внутренний цилиндры неподвижны. Средний вращается электродвигателем. При вращении среднего цилиндра попеременно открывается окно возбуждения или измерения свечения. Объект помещается во внутренний неподвижный стакан ближе к окну регистрации; освещение объекта производится красным светом. Время

между возбуждением и измерением послесвечения определяется скоростью вращения

электродвигателя и составляет обычно несколько миллисекунд. Установка позволяет

регистрировать короткоживущие компоненты послесвечения с тау= 10-3 – 10-2 с. При исследовании взаимосвязи интенсивности короткоживущей компоненты

послесвечения с процессами фотосинтеза обычно измеряют кривые индукции замедленной флуоресценции - зависимости интенсивности миллисекундного послесвечения от времени освещения растений возбуждающим светом. Следует отметить, что прерывистый свет возбуждения оказывает на фотосинтетические процессы такое же действие, как и постоянный свет. Типичная индукционная кривая миллисекундной замедленной флуоресценции

интактных листьев приведена на рис.6.

Рис.6 Индукционные кривые миллисекундной компоненты замедленной флуоресценции

листа гороха, измеренные после темновой адаптации 10, 2, 1 мин, 30 и 10 сек. Шкала времени направлена справа налево.

При включении света наблюдается сначала быстрое, а затем медленное нарастание

интенсивности послесвечения до максимального значения. Медленное увеличение

интенсивности отражает увеличение электрохимического градиента протонов на

тилакоидной мембране (дельтамюаш) во время освещения. Обработка листьев разобщителями,

снимающими этот градиент, приводит к исчезновению медленной фазы на индукционной

кривой. Стадия спада интенсивности послесвечения при длительном освещении

наблюдается только на интактных листьях, в которых осуществляются темновые реакции

фиксации СО2, утилизирующие продукты световой стадии фотосинтеза (АТP, НАDPН2).

Снижение концентрации АТP в клетке при длительном освещении активирует его ресинтез, который осуществляется за счет энергии протонного градиента на мембране, что, в свою очередь, приводит к уменьшению интенсивности послесвечения. Это также позволило использовать метод ЗФ для оценки степени энергизации мембраны хлоропластов и связанной с ней фотосинтетической продуктивности фитопланктона. Вид индукционной кривой очень сильно зависит от состояния исследуемого объекта (с диуроном она прижалась к оси) - в зависимости от режима предшествующего освещения листьев, изменения температуры и др. вызывает значительное варьирование формы кривой послесвечения.

Очевидно, интенсивность ЗФ пропорциональна количеству РЦ в состоянии Р680+Q- с разделенными зарядами. Это состояние зависит от скорости последующих стадий переноса электрона. При действии повреждающих факторов на фотосинтетический аппарат концентрация РЦ в состоянии Р680+Q- может изменяться. Это позволяет использовать ЗФ для обнаружения загрязнений в водной среде.

В результате проведенных работ созданы, испытаны и используются для поведения экологических исследований следующие приборы: зонд-флуорометр, предназначенный для измерения в природных водах (in situ) на глубине до 200 м обилия фитопланктона и эффективности функционирования его фотосинтетического аппарата, а также регистрирующий подводную облученность и температуру, что позволяет рассчитывать первичную продукцию; проточный флуорометр, предназначенный для измерения в природных водах по ходу судна обилия фитопланктона и эффективности функционирования его фотосинтетического аппарата и снабженный спутниковой системой непрерывной регистрации географических координат; бортовой флуорометр для исследования адаптационных характеристик состояния фотосинтетического аппарата проб природного фитопланктона и культур водорослей; микрофлуорометр, позволяющий измерять параметры флуоресцентные одиночных клеток водорослей; дистанционный флуорометр для бесконтактного измерения эффективности фотосинтеза и скорости прироста биомассы посевов высших растений; флуорометрический индикатор функционального состояния фотосинтетического аппарата листьев и однолетних побегов высших растений, предназначенный для проведения массовых обследований деревьев и кустарников на больших территориях.