Б.2. Объекты цитогистологического исследования

● Цитогистологический анализ применяется в медицинской практике, научных работах, учебном процессе. Производится исследование:

• трупного материала (патологоанатомические и судебно-медицинские экспертизы);

• материала прижизненной медицинской диагностики (кровь, ликвор, амниотическая жидкость, послеродовая плацента, слюна, иссеченные фрагменты объектов хирургических операций);

• органов и тканей экспериментальных животных ;

• живых клеток и тканей в культуре и т.д.

●Основными объектами микроскопического исследования клеток, тканей и органов являются изготовленные из них гистологические препараты.

● Для изготовления гистологических препаратов используют: мазки, соскобы, отпечатки, биоптаты, пленочные биообъекты, ультрацентрифугаты, тонкие и ультратонкие срезы кусочков органов, материалы культивирования.

Б.2.1. Изготовление гистологического препарата

Для изготовления гистологических препаратов в учебных и медицинских целях особенно часто используются срезы органовтолщиной (5–10 мкм). Их изготовление представляет собой сложную и кропотливую работу, которая включает в себя пять основных этапов.

Взятие материала.

● Фиксация материала (консервация с помощью химических фиксаторов или замораживания).

● Уплотнение материала (пропитывание уплотняющими средами или замораживание) – необходимо для последующего изготовления срезов. В качестве уплотнителей применяют расплавленный парафин, целлоидин, эпоксидные смолы.

● Изготовление срезов (производится на приборах - микротомах) – для световой микроскопии толщина среза 5-10 мкм, для электронной – 50-60 нм. Прибор, в котором осуществляют резание замороженного материала называется криостат.

● Окрашиваниесреза (см. ниже Б.2.1.2)

● Монтированиесрезов на предметном стекле.

▬Для приготовления долгосрочных гистологических препаратов срез помещают в заливочную среду между предметным и покровным стеклом. Заливочная среда должна обладать коэффициентом преломления световых лучей близким к стеклу. В качестве заливочных сред чаще используют смолы пихтовых деревьев («канадский бальзам»), желатину, ряд синтетических композиций.

▬При изготовлении временного гистологического препарата срез помещают в воду или глицерин на специальном предметном стекле.

Б.2.1.2. Окрашивание гистологического среза применяют для усиления визуализации изучаемых структур. Для этой цели применяют гистологическими красителями, Для исследования химического состава структур препарат обрабатывают гистохимическими красящими реагентами (гистохимический анализ).

Эти манипуляции, как правило, осуществляют пред этапом монтирования препарата на предметном стекле.

● Гистологические красители подразделяются на щелочные и кислые. Они позволяют исследовать общий план строения клетки, т.е. определить наличие и оценить основные свойства ядра и цитоплазмы.

● Структуры клеток и межклеточного вещества, окрашивающиеся основными (щелочными) красителями, называются базофильными, а окрашивающиеся кислыми красителями – оксифильными. Базофилию клеточным структурам придают, в частности, нуклеиновые кислоты, а оксифилию – щелочные белки.

▬ Одним из наиболее распространенных основных красителей является гематоксилин. Он окрашивает базофильные структуры в фиолетовый цвет (например, ядро клетки, в котором много нуклеиновых кислот). У молодых интенсивно делящихся клеток базофилией обладает и цитоплазма.

▬ Примером кислых красителей является эозин,окрашивающий оксифильные структуры в розовый цвет (например, цитоплазму дифференцированных клеток).

▬ В практике гистологических исследований с помощью светового микроскопа для окрашивания препаратов часто используются комбинации основных и кислых красителей (например: гематоксилин-эозин, азур – эозин и др.).

▬ При экспресс-диагностике (в т.ч. в хирургической и стоматологической практике) применяют прижизненные (суправитальные) методы окрашивания мазков, отпечатков, соскобов с помощью целого ряда красителей – метиленовый синий, толуидиновый синий, метилоранж и др. В этих случаях чаще применяют фиксацию объекта быстрым замораживанием.

Б.2.1.3. Импрегнации – группа визуализирующих методов обработки объектов для светооптического гистологического исследования. Они основаны на процессах элективного осаждения и восстановления солей тяжелых и драгоценных металлов (азотнокислое серебро, хлорное золото и др.) на некоторых структурах. Часто применяются при изучении элементов нервной ткани (нервные волокна, нервные окончания и др.).

Б.2.1.4. Контрастирование ультратонких срезов толщиной 50-60 нм для электронной микроскопии производится мелкодисперсными соединениями (четырехокись осмия), которые осаждаются на липидсодержащих структурах и не пропускают или задерживают электроны.