Гл а в а 2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В БИОТЕХНОЛОГИИ

Характер биологической системы (микроорганизмы, клеточные ли­нии насекомых, растений и млекопитающих, многоклеточные организ­мы) исключительно важен для биотехнологического процесса. Во мно­гих случаях именно генетически модифицированная самовоспроизво­дящаяся биологическая единица (микроорганизм, вирус, растение или животное) является конечным коммерческим продуктом.

Прокариоты и эукариоты. Все живые организмы принято делить на две основные группы: прокариоты и эукариоты. Приблизительно 1,5 млрд лет назад произошел переход от маленьких клеток со сравни­тельно простой внутренней структурой (так называемых прокариот, к которым относятся различные бактерии) к большим по размеру и зна­чительно более сложно устроенным эукариотическим клеткам, подоб­ным клеткам высших животных и растений.

Основные структурные различия про- и эукариот:

• наличие или отсутствие ядра, содержащего хромосомную ДНК;

• строение и химический состав клеточной стенки;

• наличие или отсутствие субклеточных цитоплазматических ор-ганелл.

В прокариотической бактериальной клетке хромосомная ДНК нахо­дится непосредственно в цитоплазме, клетка окружена ригидной кле­точной стенкой. В клетке нет субклеточных цитоплазматических орга-нелл (рис. 3). В оптимальных условиях прокариотическая клетка может делиться каждые 20 мин и таким образом давать жизнь более 10 млрд клеток менее чем за сутки.

В эукариотической клетке (рис. 4) имеется ядро, отделенное от ци­топлазмы ядерной мембраной, хромосомная ДНК находится в ядре. В цитоплазме содержатся различные субклеточные органеляы: мембраны, окружающие ядро, митохондрии, образующие лабиринт эндоплазмати-ческого ретикулума (ЭПР), где синтезируются липиды и мембранные белки. Мембраны формируют стопки уплощенных пузырьков, состав­ляющих аппарат Гольджи, который участвует в синтезе и транспорте различных органических молекул. Мембраны окружают лизосомы (суб-

клеточные структуры диаметром 0,20-0,5 мкм), содержащие гидроли-тические ферменты, необходимые для внутриклеточного пищеварения.

Мембраны, таким образом, защищают от действия этих ферментов бел-ки и нуклеиновые кислоты самой клетки. Мембраны также окружают пероксисомы, содержащие окислительные ферменты, производящие и разрушающие опасные высокореакционоспособные перекиси (пероксиды). Обмен между внутриклеточными, окруженными мембранами струк-\турами и внеклеточной средой происходит с помощью эндоцитоза.

Различают две группы бактерий - эубактерии, населяющие почву, воду и другие организмы, и архебактерии, встречающиеся в таких сре­дах обитания, как болота, океанские глубины, очень соленые воды и горячие кислые источники.

Исходя из температурного режима, который предпочитают те или иные микроорганизмы, их подразделяют на термофилы (от 45 до 90 °С и выше), мезофилы (от 10 до 47 °С) и психрофилы или психротрофы (от -5 до 35 °С). Микроорганизмы, активно размножающиеся лишь в определенном диапазоне температур, - полезный инструмент для реше­ния различных биотехнологических задач. Например, термофилы часто служат источником генов, кодирующих термостабильные ферменты, а генетически видоизмененные психротрофы используются при пони­женной температуре для биодеградации токсичных отходов, содержа­щихся в почве и воде.

Среди множества биологических объектов, использующихся в МБТ, основными «рабочими лошадками» являются бактерии Еscherichia coli, одноклеточные дрожжи Sacharomyces сеrevisiae и различные клеточные линии животного происхождения. Все они играют важную роль в полу­чении белков, кодируемых клонированными генами.

Е. сoli — грамотрицательная непатогенная подвижная палочка дли­ной менее 1 мкм. Традиционная среда ее обитания — кишечник челове­ка, может также высеваться из почвы и воды. Штаммы Е. сoli культиви­руются на обогащенных жидких питательных средах, содержащих ами­нокислоты, витамины, соли, микроэлементы и источник углерода. Е. соН можно культивировать в аэробных и анаэробных условиях, но для оптимальной продукции рекомбинантных белков Е. соli и другие мик­роорганизмы обычно выращивают в аэробных условиях. Рост клеточ­ной массы и продукция белка лимитируются содержанием в питатель­ной среде растворенного кислорода, для этого в ферментерах создают условия аэрации.

Кроме Е. соН в МБТ используют множество других микроорганиз­мов, которые подразделяют на две группы:

• микроорганизмы как источники специфических генов (напри­мер, ген, кодирующий стабильную ДНК-полимеразу, которая используется в широкоприменяемой полимеразной цепной ре­акции — ПЦР; этот ген был выделен из термофильных бактерий и клонирован в Е. соН).

• микроорганизмы, созданные генноинженернымми методами для решения определенных задач (например, различные штам­мы Согуnebacterium glutamicumт, генетически модифицирова-ные с целью повышения продукции промышленно важных аминокислот).

Saccharomycesс cereае - непатогенные одноклеточные организмы с диаметром клетки около 5 мкм, во многих отношениях представляют эукариотический аналог Е. сoli. S. сегеvisiае размножаются почковани­ем, их способность к превращению сахара в этанол и углекислый газ издавна использовалась для изготовления напитков и хлеба. Клетки дрожжей делятся каждые 1,5-2 ч. S. сегеvisiае является удобной моде­лью для исследования других эукариот, в т.ч. человека, так как многие гены, ответственные за регуляцию клеточного деления S. ссегеvisiае, сходны с таковыми у человека. Это способствовало идентификации и характеристике генов человека, отвечающих за развитие новообразова­ний. Генетическая система дрожжей является непременным участником всех исследований по изучению ДНК человека.

Синтезированный бактериальной клеткой эукариотический белок часто подвергают ферментативной модификации, присоединяя к белко­вой молекуле низкомолекулярные соединения, что необходимо для пра­вильного функционирования белка. Однако Е. соН и другие прокариоты не способны осуществлять эту модификацию, поэтому для получения полноценных эукариотических белков используют S. сегеvisiае и другие виды дрожжей.

В качестве биологических систем в МБТ используют культуру эу­кариотических клеток. Кусочек ткани определенного организма (насе­комого, растения, млекопитающего) обрабатывают протеолитическими ферментами (трипсином), расщепляющими белки межклеточного мате­риала; при работе с растительными клетками используют ферменты, разрушающие клеточную стенку. Высвободившиеся клетки помещают в питательную среду, содержащую аминокислоты, антибиотики, витами­ны, соли, глюкозу, факторы роста. В этих условиях (деление клеток млекопитающих происходит примерно раз в сутки) на стенке емкости с культурой образуется клеточный монослой. Если после этого не пере­нести клетки в емкости со свежей питательной средой, рост прекраща­ется. Обычно удается переносить (перевивать, субкультивировать) и поддерживать до 50-100 клеточных генераций исходной (первичной) клеточной культуры, затем клетки начинают терять способность к де­лению и гибнут.

В МБТ устойчивые линии используют для крупномасштабного про­изводства вакцин и рекомбинантных белков, для размножения вирусов и выявления белков, которые кодируются клонированными последова­тельностями ДНК.

Тест-контроль к главам 1-2 Выберите правильные ответы: