Приготовление посевного материала

Штаммы микроорганизмов для производства биологических препа­ратов поступают в ампулах, где они законсервированы в виде чистых культур. Каждая культура имеет паспорт с описанием питательных сред, морфологических, физиологических и других характеристик, ус­ловий для их поддержания, выращивания и срока хранения. Режим хра­нения культур предполагает охлаждение, замораживание или обезвожи­вание; во всех случаях должен быть резко сокращён или полностью прекращён клеточный обмен веществ. Культуры штаммов хранят: на косом агаре при температуре минус 1-5 °С; замороженными при температуре ниже —20 °С (недопустимо повторное оттаивание и замораживание);

лиофилизированными в ампулах, хранящимися в течение не­скольких лет.

Большинство культур клеток млекопитающих, в том числе и клеток человека, удается сохранить неопределенно долгое время заморожен­ными в специальной среде при температуре - 180 °С.

Через определённое время, специфическое для каждого вида микро­организмов и вида хранения, культуру пересеивают.

Перед началом технологического процесса культуру размножают в стерильных условиях при оптимальном составе питательной среды и режиме выращивания, длительность стадии выращивания — 24 ч.

Культивирование

Стадия культивирования микроорганизмов является наиболее сложной и ответственной.

Рост и культивирование биомассы требуют следующих условий:

•жизнеспособности посевного материала;

•наличия источника энергии (тепла);

• достаточного количества соответствующей питательной среды;

• необходимых физико-химических условий для жизнедеятельно­сти.

С начала 1950-х гг. вирус полиомиелита для производства вакцины выращивали в культуре клеток млекопитающих, в том числе фибробла-стов эмбриона человека. С тех пор фибробласты эмбриона стали неза­менимы для выделения и выращивания ряда других вирусов, при про­изводстве высокоспецифичных белков (антител, интерферонов), в ис­следованиях рака и противовирусной химиотерапии.

Культуры, приготовленные непосредственно из тканей организма (эмбриональных или тканей новорожденных), называют первичными культурами. В большинстве случаев клетки первичной культуры пере­носят из культуральной чашки и используют для получения большого количества вторичных культур, которые можно последовательно пе­ревивать в течение недель или месяцев. Разные типы клеток нуждаются в различных питательных веществах, а также в одном или нескольких белковых факторах роста.

Клеточные линии можно использовать для получения клонов, кото­рые происходят из одной клетки-предшественника.

Биотехнология использует методы поверхностного и глубинного культивирования микроорганизмов.

При поверхностном культивировании (в монослое) суспензию кле­ток получают обработкой измельчённой ткани эмбриона трипсином. Клетки в такой суспензии, оседая на плотной поверхности сосуда с культуральной средой, становятся плоскими иделятся, образуя моно­слой на поверхности сосуда. Обычно при этом способе культивирова­ния пользуются цилиндрическими бутылями, которые медленно вра­щаются вдоль своей длинной оси. Рост клеток и выход биомассы можно увеличить, добавив к суспензии носитель — микроскопические гранулы из инертного синтетического полимера, на которых клетки закрепляют­ся и пролиферируют. Суспензионные культуры можно получать в сосу­дах объёмом до 1000 л при перемешивании.

Преобладающим является глубинный метод культивирования, предполагающий возможность использования всего объема питатель­ной среды.

На рост и развитие микроорганизмов влияют внутри- и внеклеточ­ные факторы. К внутриклеточным факторам относятся: структура клет­ки, механизмы метаболизма и генетические характеристики. Внекле­точные (внешние) факторы, т.е. условия внешней среды клетки, явля­ются основными регуляторны.ми факторами биотехнологии.

Промышленное культивирование и очистка целевого продукта -процессы многоступенчатые. Общая схема ферментации представлена на рис. 8.

Процесс начинается с приготовления и стерилизации культуральной среды и оборудования. Вначале выращивают исходную культуру (5-10 мл), затем инкубируют ее во. встряхиваемой колбе (200-1000 мл), далее переносят в ферментер для посевного материала (10-100 л) и, наконец, в промышленный ферментер (1000-100000 л). По завершении ферментации выделяемый продукт находится в клетках или в культуральной среде, но не в обеих фракциях одновременно, поэтому дальнейшие манипуляции проводят с одной из этих фракций.

Микроорганизмы можно выращивать:

• в ферментере периодического действия;

• в ферментере периодического действия с добавлением субстрата;

• в непрерывной культуре.

В первом случае микроорганизмы выращивают в стерильных усло­виях без добавления в ходе ферментации свежей культуральной среды. При периодической ферментации состав культуральной среды, концен­трация микроорганизмов (биомассы), количество белкового продукта или метаболита зависят от фазы роста, клеточного метаболизма и нали­чия питательных веществ.

Различают шесть основных фаз роста (рис. 9):

лаг-фаза (1);

фаза ускорения (2);

экспоненциальная или логарифмическая фаза (3);

фаза замедления (4);

стационарная фаза (5);

фаза отмирания (6).

Как правило, после инокуляции стерильной культуральной среды мгновенного увеличения числа клеток не наблюдается. В течение опре­деленного периода времени, называемого лаг-фазой, клетки адаптиру­ются к новым условиям (другим рН или концентрации питательных веществ). Продолжительность лаг-фазы зависит от времени, в течение которого клетки посевного материала находились в стационарной фазе, и от того, насколько различалась среда, в которой росла культура, от новой, свежей культуральной среды. Если посевным материалом слу­жит культура, находящаяся в экспоненциальной фазе, выраженная лаг-фаза может отсутствовать и рост клеток начнется немедленно после инокуляции. Между лаг- и экспоненциальной фазами есть короткий период — фаза ускорения, когда скорость роста клеток увеличивается до достижения постоянной величины. В период экспоненциальной фазы клетки претерпевают несколько делений. Когда субстрат присутствует в избытке, достигается максимальная скорость роста культуры в экспо­ненциальной фазе, из-за большого числа клеток в конце экспоненци­альной фазы субстрат расходуется очень быстро, наступает фаза замед­ления, которая может быть кратковременной. В результате истощения лимитирующего субстрата или накопления продуктов метаболизма, замедляющих рост, увеличение числа клеток постепенно прекращается

и культура переходит в стационарную фазу. В это время биомасса оста­ется постоянной, метаболизм претерпевает кардинальные изменения, синтезируются соединения (вторичные метаболиты), представляющие коммерческий интерес, например антибиотики. Продолжительность стационарной фазы зависит от конкретного микроорганизма и условий роста. В фазе отмирания метаболизм прекращается, так как энергети­ческие запасы клеток оказываются исчерпанными. При промышленном синтезе, еще до наступления фазы отмирания, ферментацию останав­ливают.

Периодическая культура с добавлением субстрата предполагает периодическое внесение в ферментер увеличивающегося количества питательных веществ. При этом культуральную среду не удаляют до окончания процесса. Периодическое добавление субстрата приводит к удлинению экспоненциальной и стационарной фаз, к увеличению био­массы и количества метаболитов, синтезируемых во время стационар­ной фазы. Для обеспечения непрерывного синтеза рекомбинантного белка и его стабильности необходим тщательный контроль процесса и добавление субстрата (источника углерода, азота, витаминов, микро­элементов и др. БАВ) тотчас, как в этом возникает необходимость.

В зависимости от генотипа микроорганизма и природы рекомби-нантного белка периодическая ферментация с добавлением субстрата может повысить выход готового продукта на 25-1000% по сравнению с простой периодической ферментацией.

Периодическая ферментация с добавлением субстрата используется также для культивирования клеток млекопитающих и насекомых; эти культуры широко применяют для получения белковых продуктов, имеющих медицинское значение, кроме того, без периодического до­бавления субстрата, клетки млекопитающих неэффективно синтезиру­ют чужеродные белки. Для периодической ферментации характерны небольшие различия во времени сбора клеток, который проводят, начи­ная с середины экспоненциальной фазы, и заканчивают ее поздним этапом.

Однако в стационарной фазе микроорганизмы часто синтезируют протеолитические ферменты - протеиназы, разрушающие производи­мые белки; если цель ферментации - получение белковых продуктов, нужно остановить процесс до перехода его в стационарную фазу. Опре­деляя время добавления следующей порции субстрата, используют по­казатели, коррелирующие с его расходом: количество синтезированных органических кислот, значение рН или количество образовавшегося СО₂. Конечный продукт собирают по завершении процесса.

При непрерывной ферментации свежая культуральная среда посту­пает в ферментер непрерывно, параллельно отводится такой же объем клеточной суспензии. Таким образом, убыль числа клеток (удаление продукта) уравновешивается их увеличением в результате деления. При этом жестко контролируют скорость притока культуральной среды и постоянный объем культуры в биореакторе.

Следует заметить, что в промышленных целях непрерывная фер­ментация применяется реже, хотя стоимость получения определенного количества биомассы в ферментере непрерывного действия существен­но ниже, чем в биореакторе, работающем в периодическом режиме. Это удешевление обусловлено следующим:

-при непрерывной ферментации нужны не столь громоздкие биореакторы и оборудование для сбора клеток, их разрушения, последующей очистки белкового продукта или метаболита, син­тезированного микроорганизмами;

-биореактор периодического действия время от времени разгру­жают, готовя к повторному использованию (ремонт, чистка, стерилизация биореактора - основная причина снижения эф­фективности процесса); для ферментера, работающего в непре­рывном режиме, простой существенно меньше;

- при непрерывной ферментации синтез целевого продукта про­исходит более согласованно, так как физиологический статус большинства клеток одинаков.

Непрерывную ферментацию используют для промышленного полу­чения белков одноклеточных микроорганизмов и антибиотиков, однако и этот способ выращивания микроорганизмов связан с определенными затруднениями:

• продолжительность ферментации в непрерывном режиме со-ставляет иногда 500-1000 ч, в течение которого некоторые клетки могут потерять рекомбинантные плазмиды (известно, что клетки, не несущие плазмид, расходуют меньше энергии, делятся быстрее, поэтому со временем выход целевого продук­та может снижаться из-за уменьшения числа клеток, способ­ных его синтезировать);

• в промышленных установках затруднительно в течение дли­тельного времени поддерживать стерильные условия; непре- • рывные процессы требуют наличия стерильного резервного оборудования, что значительно увеличивает основные затраты.

Культуры с высокой плотностью. При максимальной конечной плотности культуры получается и максимальное количество целевого продукта. В ферментерах периодического действия с добавлением суб­страта концентрация рекомбинантных клеток Е.соli достигает 50 г сухо­го вещества на 1 л питательной среды (в некоторых случаях более 100 г/л). Один из способов повышения плотности культуры — оптимиза­ция культуральной среды.

Следует иметь в виду, что некоторые питательные вещества (в том числе источники углерода, азота) при высоких концентрациях замедля­ют рост клеток. Так, глюкоза подавляет рост при концентрации более 50 г/л, аммиак - при концентрации свыше 3 г/л; железо, магний, фос­фор, цинк соответственно - более 1,15 г/л, 8,7 г/л, 10 г/л, 0,038 г/л.

Таким образом, простое увеличение содержания питательных ве­ществ в культуральной среде при периодической ферментации не дает желаемого результата.

Для избежания недостатка кислорода в культурах с высокой плот­ностью повышают количество поступающего диспергированного воз­духа и скорость перемешивания. Возможна подача в культуру чистого кислорода, а не воздуха (содержащего только 20% кислорода) или вы­ращивание клеток под определенным давлением для увеличения рас­творимости кислорода.

Высокой плотности роста культуры удается достичь в периодиче­ском режиме с добавлением субстрата. Режим подачи питательных ве­ществ может быть: непрерывным, ступенчатым, экспоненциальным. При непрерывном режиме в культуральную среду в течение всей фер­ментации вносят одинаковые количества питательных веществ. При ступенчатом режиме питательные вещества добавляют во все боль­шем количестве по мере увеличения концентрации клеток. При экспо­ненциальном режиме питательные вещества добавляют в количестве, обеспечивающем постоянную скорость роста клеток.

Периодическую подачу питательных веществ автоматизируют, ос­новываясь на результатах измерения концентрации лимитирующего субстрата культуральной среды (например глюкозы) в процессе фер­ментации.

При крупномасштабной ферментации следует учитывать еще один аспект. Важно не допустить случайного попадания рекомбинантных микроорганизмов в окружающую среду; для этого используют надежные системы, предотвращающие утечку живых рекомбинантных организмов или ограничивающие их распространение при произошедшей утечке.

Перед окончательным удалением из установки, все рекомбинантные микроорганизмы должны быть инактивированы в соответствии с опре­деленными инструкциями. Использованную культуральную среду тща­тельно проверяют на наличие в ней жизнеспособных микроорганизмов, чтобы исключить их попадания в окружающую среду.

5.4. Аппаратурное оформление биотехнологического процесса.

Биореакторы

Промышленное производство биопрепаратов представляет собой сложный комплекс взаимосвязанных физических, химических, биофи­зических, биохимических, физико-химических процессов и предполага­ет использование большого количества разнотипного оборудования, которое связано между собой материальными, энергетическими пото­ками, образующими технологические линии.

Основным аппаратурным элементом биотехнологического процесса является биореактор - ферментер(рис. 10). Биореакторы предназначе­ны для культивирования микроорганизмов, накопления биомассы, син-

теза целевого продукта. Биореакторы изготавливают из высоколигиро-ванных марок стали, иногда из титана. Внутренняя поверхность биоре­актора должна быть отполирована.

Типовые ферментеры представляют собой вертикальные ёмкости различной вместимости (малые - от 1 до 10 л, многотоннажные - более 1000 л) с минимальным числом штуцеров и передающих устройств. В биореакторах должны быть обеспечены оптимальные гидродинамиче­ские и массообменные условия.

Ферментеры снабжены паровой рубашкой, мешалками, барботера-ми, стерилизующими воздушными фильтрами, отбойниками, обеспечи­вающими необходимые температурный, газовый режим, гидродинами­ческую обстановку в биореакторе (т.е. процессы массо- и теплообмена). В биореакторах имеются пробоотборцики для отбора проб культураль-ной жидкости в процессе биосинтеза. Могут быть и другие конструк­тивные особенности, учитывающие специфику биотехнологического процесса. Работа отдельных узлов контролируется измерительными приборами, фиксирующими как параметры технологического процесса, так и отдельные физико-химические показатели культивирования (тем­пературу стерилизации и культивирования, скорость вращения мешал­ки, давление, расход воздуха или газов на аэрацию, пенообразование, рН, еН, рО₂, рСО₂ среды).

Тип биореактора, чистота обработки внутренних стенок аппарата и отдельных его узлов, ёмкость, коэффициент заполнения, поверхность теплоотдачи, способ отвода тепла, тип перемешивающих, аэрирующих устройств, арматура и запорные приспособления, способ пеногашения, — далеко не полный перечень отдельных элементов, которые, в отдель­ности и во взаимосвязи, влияют на процесс культивирования микроор­ганизмов и клеток.

Биореакторы подразделяют на три основные группы (рис. 11):

1) реакторы с механическим перемешиванием;

2) барботажные колонны, через которые для перемешивания со­держимого пропускают воздух;

3) эрлифтныереакторы с внутренней или внешней циркуляцией; перемешивание и циркуляция культуральной среды в них обес­печивается потоком воздуха, за счет которого между верхним и нижним слоями культуральной среды возникает градиент плот­ности.

Биореакторы первого типа используют чаще всего, так как они по­зволяют легко изменять технологические условия и эффективно достав­лять к растущим клеткам воздух, определяющий характер развития микроорганизмов и их биосинтетическую активность. В таких реакто­рах воздух подают в культуральную среду под давлением через раз­брызгиватель - кольцо с множеством маленьких отверстий. При этом

Биореакторы первого типа используют чаще всего, так как они по­зволяют легко изменять технологические условия и эффективно достав­лять к растущим клеткам воздух, определяющий характер развития микроорганизмов и их биосинтетическую активность. В таких реакто­рах воздух подают в культуральную среду под давлением через раз­брызгиватель - кольцо с множеством маленьких отверстий. При этом цели используют мешалки - одну или несколько. Мешалки, разбивая крупные пузырьки воздуха, разносят их по всему реактору и увеличи­вают время пребывания в культуральной среде. Эффективность распре­деления воздуха зависит от типа мешалки, числа оборотов, физико-химических свойств среды.

При интенсивном перемешивании культуральной среды происходит ее вспенивание, поэтому рабочий объем биореактора не превышает 70% общего объема. Свободное пространство над поверхностью раствора используется как буферное, где накапливается пена, и таким образом предотвращается потеря культуральной жидкости. В пенящейся жидко­сти условия аэрации лучше, чем в плотных растворах (при условии не­прерывного перемешивания и циркуляции слоя пены, т.е. при исключе­нии нахождения микроорганизмов вне культуральной жидкости). Вме­сте с тем вспенивание может привести к переувлажнению фильтров в отверстиях, через которые воздух выходит из биореактора, уменьше­нию потока воздуха и к попаданию в ферментер посторонних микроор­ганизмов.

Конструктивные особенности барботажных колонн и эрлифтных биореакторов дают этим типам ферментеров некоторые преимущества перед реакторами с механическим перемешиванием. Барботажные ко­лонны более экономичны, так как перемешивание в них происходит восходящими потоками воздуха равномерно по всему объему. Отсутст­вие механической мешалки исключает один из путей проникновения в биореактор посторонних микроорганизмов. В барботажных биореакто­рах не возникает сильных гидродинамических возмущений (сдвигов слоев жидкости культуральной среды относительно друг друга).

Уменьшение сдвиговых факторов важно по следующим причинам: клетки рекомбинантных микроорганизмов менее прочны, чем нетрансформированные;

клетка отвечает на внешние воздействие уменьшением количе­ства синтезируемых белков, в том числе рекомбинантных; под влиянием сдвиговых эффектов могут изменяться физиче­ские и химические свойства клеток, что затрудняет дальнейшую работу с ними (ухудшаются условия выделения, очистка реком­бинантных белков).

В барботажных колоннах воздух подают под высоким давлением в нижнюю часть биореактора; по мере подъема мелкие пузырьки воздуха объединяются, что влечет неравномерное его распределение. Кроме того, подача воздуха под высоким давлением приводит к сильному пе-нообразованию.

В эрлифтных биореакторах воздух подают в нижнюю часть верти­кального канала. Поднимаясь, воздух увлекает за собой жидкость к верхней части канала, где расположен газожидкостный сепаратор (здесь частично выходит воздух). Более плотная деаэрированная жидкость опускается по другому вертикальному каналу ко дну реактора и процесс повторяется. Таким образом, в эрлифтном биореакторе культуральная среда вместе с клетками непрерывно циркулирует в биореакторе.

Эрлифтные биореакторы выпускаются в двух конструктивных вари­антах. В первом - реактор представляет емкость с центральной трубой, которая обеспечивает циркуляцию жидкости (реакторы с внутренней циркуляцией). У эрлифтного биореактора второго типа культуральная среда проходит через отдельные независимые каналы (реактор с внеш­ней системой циркуляции).

Эрлифтные биореакторы более эффективны, чем барботажные ко­лонны, особенно в суспензиях микроорганизмов с большей плотностью или вязкостью. Перемешивание в эрлифтных ферментерах более интен­сивно и вероятность слипания пузырьков минимальна.

Для стерилизации биореактора применяют пар под давлением. Внутри биореактора не должно быть «мертвых зон», недоступных для пара во время стерилизации. Стерилизации подлежат все клапаны, дат­чики, входные и выходные отверстия.

Стерильность обеспечивается и герметизацией биотехнологическо­го оборудования, работающего в асептических условиях. Стерильная передача жидкости осуществляется через штуцеры парового затвора. Технологическая обвязка биореактора исключает контаминацию куль-туральной жидкости посторонней микрофлорой и возможности попада­ния продуктов биосинтеза в окружающую среду. Основные агенты, контаминирующие клеточные культуры — бактерии, дрожжи, грибы, простейшие, микоплазмы, вирусы. Источники контаминации - воздух, пыль, питательные среды, рабочие растворы, оборудование, рабочий персонал.

Очистка воздуха от микроорганизмов и аэрозольных частиц осу­ществляется через фильтры предварительной очистки (комбинирован­ные глубинные фильтры - бумага, картон, тканевые материалы), кото­рые устанавливают на всасывающей линии перед компрессором (воздух очищается от частиц размером более 5 мкм) и фильтры тонкой очистки (ткань ФП, удаляющая частицы размером до 0,3 мкм, металлокерамиче-ские и мембранные фильтры).

Металлокерамические фильтры изготовлены из калиброванных ме­таллических порошков (бронзы, никеля, нержавеющей стали, титана) способами спекания, прессования, прокатки; размер пор варьирует от 2 до 100 мкм. Металлокерамические фильтры стерилизуют при темпера­туре 150 °С 50 мин. Они стойки к действию сильных кислот, щелочей, окислителей, спиртов, могут использоваться при температуре от -250 °С до +200 °С.

Преимущество металлокерамических фильтрующих элементов -простота регенерации, большой срок работы (5-10 лет). В отличие от волокнистых, нетканных и фторопластовых фильтров, зернистые ме­таллокерамические материалы имеют неизменную структуру, химиче­ски инертны, поддаются любым методам стерилизации, отличаются высокой механической прочностью, просты в изготовлении.

Мембранные фильтры патронного и кассетного типа несмотря на менее значительный срок службы (1 год) обладают высокой эффектив­ностью, быстрой съёмностью, надёжны в работе. Отмечена способность рядом фильтрующих материалов, заряженных отрицательно, задержи­вать живые клетки, бактерии, вирусы, эритроциты, лимфоциты и тром­боциты. Частицы, размер которых меньше величины пор фильтрующе­го материала, остаются на фильтре, если дзета-потенциал (электриче­ский потенциал) частиц и стенок пор фильтра имеет противоположные заряды. Это явление- наблюдается при использовании в качестве фильт­рующих элементов мембран с соответствующими электростатическими свойствами. Выбор фильтрующего материала зависит от объекта фильтрации и дзета-потенциала суспендированных частиц.

Отработанный воздух, отводимый из лабораторных и производст­венных помещений, контролируется на чистоту (отсутствие микроорга­низмов).

Для обслуживания установок глубинного культивирования приме­няют автоматизированную модульную систему, включающую:

-очистку и стерилизацию воздуха и пара с использованием ме­таллокерамических и титановых фильтрующих элементов;

-модули технологической обвязки, содержащие автономную сис­тему термостатирования, запорную и регулирующую арматуру, индивидуальные входные и выходные фильтры, электропнев-мообразователи и другие регулирующие устройства;

-блок автоматического контроля и управления, содержащий про­граммное устройство, преобразователи сигналов от измеритель­ных электродов, газоанализаторы для измерения О₂, СО₂, еН, температуры, рСО₂, рО₂;

-системы цифровой и диаграммной индикации текущих пара­метров культивирования.

Установки глубинного культивирования снабжены блоками дистан­ционного измерения давления в биореакторе и его рубашке, блоками дистанционного контроля интенсивности аэрации воздухом или газовой смесью (кислорода и азота, кислорода и углекислого газа, воздуха и уг­лекислого газа, азота и углекислого газа).

Блок автоматического управления позволяет контролировать и под­держивать на заданном уровне программную стерилизацию биореакто­ра и арматуры, скорость вращения мешалки и дистанционный контроль открытия или закрытия вентилей и регулирующих клапанов.

Ряд стран специализируется на выпуске широкого ассортимента оборудования для культивирования различного назначения (фирма NBS - США; Полиферм, Биотек - Швеция; Марубиши - Япония; LН - Фер-ментейшн — Великобритания; Браун - Германия; БИОР-0,1, БИОР-0,2 — Россия, институт биологического приборостроения с опытным заводом АН РФ).