Белковые мишени для антибактериальных и противо-опухолевых препаратов

Появление патогенных микроорганизмов, устойчивых к традиционным антибиотикам, привело к кризису в методах лечения инфекционных болезней. Резистентность к лекарственным средствам особенно актуальна для инфекций в стационаре и требует поиска новых мишеней для противомикробных препаратов с новыми видами действия

G-белки.

Важнейшим внутриклеточным компонентом сигнальных каскадов являются G-белки. В настоящее время известно около 20 различных G-белков. Так, например, Gs и Gi стимулируют и ингибируют аденилатциклазу, соответственно; Gq активирует фосфолипазу С. Среди G-белков сенсорных клеток можно отметить: фоторецепторные - Gt (трансдуцин), обонятельные - Golf и вкусовые - Gg.

По своему строению G-белки представляют собой гетеротримеры, состоящие из трех типов субъединиц: a (альфа), b (бетта) и g (гамма), однако в нативных условиях бетта и гамма субъединицы функционируют как единый комплекс. Общей структурной особенностью G-белков является наличие семи трансмембранных альфа-спиралей. Важнейшей характеристикой G-белков является присутствие на их a-субъединице центра связывания гуаниловых нуклеотидов: GDP(гуанизидиндифосфат) и GTP (гуанизидинтрифосфат). Если с G-белком связан GTP, то это соответствует его активированному состоянию (G-GTP) или, иначе, G-белок находится в активированном положении. Если в нуклеотидсвязывающем центре присутствует GDP, то эта форма (G-GDP) соответствует "выключенному" состоянию. Ключевым моментом передачи сигнала от рецептора (на который подействовал первичный сигнал) к G-белку является катализ активированным рецептором обмена GDP, связанного с G-белком, на присутствующий в среде GTP (GDP / GTP-обмен на G-белке).

Трансмембранные рецепторы обеспечивают основные жизненно важные функции клетки: сигнальную, транспортную, защитную. Изучение механизма действия различных биологически активных соединений, в том числе противовирусных и противобактериальных показало, что наиболее специфичными мишенями, как для лекарственных, так и для токсических соединений (ядов) являются клеточные рецепторы человека и патогенных микроорганизмов. Значительную часть трансмембранных рецепторов составляют G-белок сопряженные рецепторы (GPCR), около половины всех известных в настоящее время лекарственных препаратов действуют именно на GPCR. Из всех видов поверхностных клеточных рецепторов GPCR наиболее универсальны. Эти рецепторы связывают широкий круг молекул, от, небольших по размеру нейромедиаторов, до крупных белков. GPCR вовлечены практически во все жизненно важные процессы.

Разнообразие сигналов, передаваемых GPCR, обеспечивается функциональным сопряжением разных GPCR между собой. Таким образом, очевидно, что наиболее универсальный механизм влияния токсичных и лекарственных соединений на клетку реализуется через воздействие на рецепторный аппарат клетки, путем изменения их конформации или основных характеристик связи лиганд-рецептор, их специфичности и обратимости.

Rpf-белки

Несколько лет назад было обнаружено новое семейство белков Rpf, секретируемых рядом грамположительных бактерий, способствующих оживлению покоящихся форм этих бактерий, в том числе М. tuberculosis. Было выяснено, что эти белки представляют собой бактериальные факторы роста, стимулирующие рост бактерий-продуцентов и родственных микроорганизмов. Обнаружено, что белки семейства Rpf участвуют в формировании иммунитета против туберкулеза. Инактивирование не менее трех rpfгенов из пяти приводит к снижению вирулентности микобактерий для лабораторных животных. Кроме этого, полученные мутанты, в отличие от дикого штамма, неспособны к оживления из покоящегося состояния in vitro.Таким образом, семейство белков Rpf. с большой вероятностью, участвует в феномене реактивации латентной туберкулезной инфекции.

В 2004 году была расшифрована структура консервативного домена Rpf-белков. Было установлено, что она имеет лизоцимоподобную структуру. Совсем недавно удалось зарегистрировать слабую литическую активность рекомбинантных белков Rpf по отношению к клеточной стенке бактерий. Возможность регистрации энзиматической активности Rpf-белков, а также расшифровка структуры молекулы, открывает перспективу для подбора и направленного синтеза низкомолекулярных соединений-ингибиторов функциональной активности Rpf, которые смогут тормозить размножение возбудителя в организме, и в частности, предотвращать реактивацию латентного туберкулеза.

Клеточные сортазы

Один из новых подходов к снижению патогенности грамположительных бактерий заключается в нарушении фиксации бактериальных поверхностных белков, способствующей проникновению патогена в организм хозяина.

Грамположительные бактерии продуцируют поверхностные белки, способствующие присоединению бактерии к клеткам организма-хозяина и препятствующие фагоцитозу. Поверхностные белки подвергаются катализируемому ферментом-сортазой процессу трансформации на клеточной стенке. Так S. aureus сортаза (SrtA) катализирует транспептидную реакцию, при которой поверхностный белок бактерии, расщепляется по связи между треониновым (Т) и глициновым (G) остатками. Затем карбоксильная группа треонина присоединяется к аминогруппе пентаглицинового мостика пептидогликана клеточной мембраны. Посредством этой реакции поверхностные белки ковалентно связываются с клеточной стенкой. Было показано, что сортаза играет существенную роль в функциональности поверхности бактериальной клетки, экспрессирующей вирулентные факторы, и патогенезе большого ряда инфекций, вызываемых S. aureus, от повреждений кожи и мягких тканей до эндокардита, септического артрита, остеомиелита и токсического шока. Таким образом, подавление сортазной активности может рассматриваться как новый подход к лечению инфекций, вызываемых грамположительными бактериями, дополняющий использова-ние стандартных методов, использующих традиционные антибиотики.

Сотрудниками Химического факультета МГУ были синтезированы новые классы низкомолекулярных SrtA-ингибиторов, являющихся производными пролина, тестирование которых привело к обнаружению соединений, подавляющих транспептидазную активность S. Aureus SrtA.

Протеинкиназы

Известно, что в важную роль в развитии большого числа онкологических заболеваний могут принимать участие такие ферменты как протеинкиназы, катализирующие фосфорилирование различных белков. Определенные протеинкиназы активно участвуют в клеточных сигнальных каскадах, регулирующих, в том числе и пролиферативную активность клеток. Также известно, что многие опухолевые клетки отличаются повышенной экспрессией некоторых протеинкиназ, что приводит к повышению частоты делений опухолевой клетки. Принимая во внимание эти факты, можно предположить что, ингибируя протеинкиназы клеток можно предотвратить деление, а, следовательно, и рост опухоли.

Не менее важную роль играют протеинкиназы в формировании МЛУ бактерий. Фосфорилируя различные белковые молекулы они делают их нечувствительными к действию различных антибактериальных препаратов. Так сотрудниками Научно-исследовательского центра биотехнологии антибиотиков (г. Москва) был установлен новый механизм устойчивости бактерий к антибиотикам аминогликозидам: фосфорилирование бактериальной аминогликозид-фосфотрансферазы серин-треониновой протеинкиназой, что защищает ее от воздействия антибиотика. Были синтезированы эффективные ингибиторы протеинкиназ, относящиеся к классу бисмалеинимидов, причем некоторые из них уже находятся в стадии предклинических испытаний. Предполагается, что в случае успешного прохождения клинических испытаний ингибиторы протеинкиназ могут быть использованы в комбинации с антибиотиками или противоопухолевыми препаратами для преодоления МЛУ у ряда грамположительных бактерий и при злокачественных опухолях.

Таким образом, точное выяснение механизма болезни, поиск и выбор оптимальных биомишеней для действия лекарственных препаратов является важнейшим, можно сказать ключевым условием для ее излечения. Однако сама по себе эта информация мало что значит, если необходимых лекарств нет. Поэтому в общем объеме затрат (временных, трудовых, финансовых) на создание нового лекарства нахождение и оптимизация биомишеней занимает лишь небольшую часть и служит для максимально возможного упрощения и сокращения следующего этапа, который включает в себя:

1. Поиск новых физиологически – активных веществ (соединений “лидеров”, lead-compounds, lead-identification) на базе которых будут создаваться новые лекарства.

2. Модификацию и оптимизацию соединений “лидеров” с целью повышения активности и селективности (избирательности) действия, снижения токсичности (lead-optimization).

Конечным результатом второго этапа является создание и передача на предклинические и клинические испытания нового лекарственного препарата с заданными свойствами.

2.2. Стратегия поиска соединений – лидеров.

Существует несколько основных вариантов поиска соединений - лидеров:

1. Случайное нахождение (сульфаниламиды, пенициллин).

2. Использование в качестве соединения – лидера уже известного лекарства, у которого целенаправленно усиливается либо основное (пенициллин – полусинтетические пенициллины), либо побочное действие (виагра).

3. Тотальный (сплошной, массовый) скрининг больших массивов природных или синтетических соединений с определенной структурой.

4. Рациональное (целенаправленное) конструирование соединения лидера на основе знаний о строении молекулы биомишени и комплекса мишень - лиганд, мишень – ингибитор (докинг).

Несмотря на различия, первые три варианта имеют много общего, т.к. основываются на случайном поиске определенных, интересующих человека признаков среди уже имеющихся либо впервые синтезируемых или обнаруживаемых веществ. Этот подход существует столько, сколько существует сама медицина, однако в последнее время и здесь широко стали применяться новые технологии, основанные на последних достижениях молекулярной биологии и биотехнологии. Наиболее ярким примером является поиск соединений “лидеров” на основе сочетания методов комбинаторной химииивысокопроизводительного скрининга (high throughput screening, HTS).