Моделирование пространственных структур белков.

В настоящее время существует единственный ме­тод моделирования пространственной структуры бел­ка, дающий достаточно точные модели, пригодные для технологии SBDD. Это метод моделирования структу­ры белка по гомологии, основанный на схожести пер­вичных и пространственных структур исследуемого белка и его гомологов, для которых пространственная структура известна.

Широко­масштабные эксперименты показали, что точ­ность модели белка, построенной по гомологии, зави­сит от схожести последовательностей моделируемого белка и белка-гомолога. Как правило, хороший ре­зультат получается, когда идентичность последова­тельностей превышает 40%. При идентичности менее 30% точность расчетов резко уменьшается.

2.1.4. Конечная селекция и приоритезация потенциальных мишеней

В настоящее время этот самый критический этап процесса создания новых лекарств может быть выполнен только вручную. На данном этапе произво­дится оценка возможных финансовых и временных затрат и ряда плохо формализуемых критериев типа функции белка и его метаболической роли. Преиму­щественно это функция белка и его метаболическая роль.

К предпочтительным мишеням относят ферменты клеточной стенки, компоненты синтеза витаминов, компоненты систем транскрипции и трансляции. Предпочтительны также ферменты, катализирующие ключевые стадии метаболизма. Что касается структур­ных и транспортных белков, а также ферментов аль­тернативных метаболических путей, то их лучше ис­ключать из списка потенциальных мишеней. С технологической точки зрения более предпочтительны водорастворимые белки по сравнению с мембранны­ми.

В последнее время активно разрабатываются высо­копроизводительные технологии экспериментальной проверки — валидации потенциальных мишеней (high-throughput target validation). Они позволяют про­водить проверку примерно 10% всех белков, кодиро­ванных типичным бактериальным геномом.

Основные типы биомишеней.

На сегодняшний день установлено, что 95% всех фармакологических средств, в той или иной степени воздействуют на белки. Поэтому именно на поиск белковых мишеней, таких как ферменты или белки сигнальных систем и рецепторов, направлено сейчас основное внимание ученых. Помимо белков в качестве биомишеней могут выступать различные нуклеиновые кислоты: ДНК (гены), РНК и некоторые метаболиты.

Генные мишени

Все гены, составляющие геном патогенных микроорганизмов, как стало ясно относительно недавно, можно разделить на две группы. Первая группа генов объединяется под названием «house keeping genes» (гены, на которых держится «дом», т.е. клетка; они всегда жизненно необходимы для ее существования, т.к. контролируют основные метаболитические процессы). Их еще называют существенные гены. Вторая, менее изученная группа, получившая условное название «гены вирулентности», существенна для сохранения жизнеспособности патогенных микроорганизмов только в условиях инфицированного организма.Кроме генов, непосредственно обусловливающих образование адгезинов и инвазинов, что способствует колонизации бактериальным патогеном животных тканей, в эту группу входят и гены, обязательные для выживания патогена в условиях воздействия на него факторов иммунитета (гены, отвечающие за выработку токсинов), гены, позволяющие микроорганизму преодолевать дефицит некоторых метаболитов и неорганических ионов (например, пуринов и железа) в организме человека, а также гены, кодирующие некоторые регуляторные системы. И те, и другие гены могут быть потенциальными биомишенями для действия лекарственных препаратов.

В принципе любые «house keeping» гены могут являться мишенями для действия антибактериальных препаратов, однако здесь имеется целый ряд существенных ограничений обусловленных общностью многих метаболитических процессов в клетках человека и бактерий. Поэтому для поиска подходящих генных мишеней первоначально проводится анализ и сопоставление геномов микроорганизмов (метаболомика) и выделяются интересующие гены. Затем компьютерным путем они накладываются на геном человека и выделяются гены общие для человека и микроорганизмов (сравнительная геномика). Такие гены исключают из дальнейшего изучения, так как воздействие на них лекарственных препаратов может иметь неблагоприятные последствия для организма человека. Оставшиеся существенные гены могут быть перспективными мишенями для различных фармпрепаратов, как существующих, так и вновь создаваемых. Так, анализ полной последовательности нуклеотидов генома микобактерии - возбудителя туберкулеза - показал, что у бактерии имеются гены, кодирующие синтез жизненно важных для нее ферментов, отсутствующих у человека. На основе такого подхода после прочтения и анализа геномов М.tuberculosis и близких к нему микроорганизмов, в НИИ биомедицинской химии РАМН предсказаны 13 новых мишеней для лекарственных соединений. Поиск лекарств, действующих именно на эти гены или кодируемые ими белки, обещает переворот в борьбе с этой инфекцией, уносящей миллионы человеческих жизней.

Более перспективными биомишенями для химиотерапевтического агента являются гены вирулентности. Подавление генов вирулентности не вызывает прекращения роста патогенных микроорганизмов in vitro, поскольку в этом случае гены вирулентности им не нужны. Однако в условиях in vivo значение генов вирулентности для патогена сравнивается со значением «house keeping genes», и их подавление будет приводить к антимикробному эффекту, поскольку патогенные клетки, потерявшие вирулентность, будет быстро уничтожаться защитными силами организма.

Ингибиторы генов вирулентности оказываются особенно ценными лекарственными веществами. Во-первых, к ним гораздо медленнее, чем к ингибиторам образования, например, клеточной стенки (пенициллины, цефалоспорины) или белка (стрептомицин, тетрациклины, эритромицин и др.), должна развиваться резистентность. Они не будут факторами селекции и распространения резистентных форм бактерий. Во-вторых, гены вирулентности высоко специфичны для каждого патогена: близких к ним генов в клетках организма человека нет. Это значит, что ингибиторы, отобранные по действию на гены вирулентности, более безопасны для человека, чем отобранные по другим тестам.

Для того чтобы использовать гены вирулентности в биоиспытаниях, надо предварительно их выделить и идентифицировать, а затем получить в чистом виде кодируемый ими белок, который можно использован как – мишень в тест-системах. Это не просто, так как гены вирулентности экспрессируются только in vivo, т.е. в инфицированном животном организме. Поэтому гены вирулентности нужно сначала выделить в чистом виде и постараться клонировать и экспрессировать в каком ни будь безопасном и легко культивируемом микроорганизме типа E.coli. Для этого был разработан метод, получивший название «in vivo expression technology» (IVET) используемый для отбора генов вирулентности (ivi гены). Геном исследуемого патогенного микроорганизма фрагментируется с помощью набора рестриктаз: в отдельных фрагментах оказываются или iviгены, или "жизненно важные" существенные гены необходимые клетке для ее роста и in vivo, и in vitro. Далее проводят их разделение и идентификацию.

Об объеме экспериментов, проводимых с использованием IVET, можно судить, например, по исследованию, в котором проводилась идентификация генов вирулентности Salmonella typhimurium. Было идентифицировано более 100 генов (относящихся к генам вирулентности), из них более 50 оказались ранее не описанными, т.е. не имели гомологии с генами, представленными в базах данных по другим организмам, а функции кодируемых ими белков были неизвестны.

В целом можно сказать, что секвенирование генома позволяет, в конечном счете, выявить абсолютно все уязвимые места клетки патогена как при росте in vitro и in vivo, так и только in vivo, что для клинической практики не менее, а может быть даже и более, важно.