Число активных генов и число копий мРНК

Методы генной инженерии, примененные к эмбриологическим объектам, показали, что в их клетках активно значительно больше генов, чем это считали раньше. Так, в ооцитах морских ежей активно около 40 тыс. генов, на бластуле и гаструле – не менее 20 тыс. и т. д. Только в дифференцированных тканях взрослого организма эти числа снижаются до 2–3 тыс. Такое же большое число активных генов было найдено и в других типах клеток: в культуре тканей млекопитающих – 20–40 тыс. генов, в культуре клеток дрозофилы – более 5 тыс., т. е. почти все ее гены.

Создается парадоксальная ситуация – в клетках активно слишком много генов. Некоторое понимание происходящего оказалось возможным тогда, когда удалось определить число копий одинаковых мРНК, приходящихся на одну клетку. Оказалось, что по числу копий эти мРНК можно разбить на три класса: очень немногие виды мРНК, которых в клетке содержится много тысяч копий, десятки или сотни видов мРНК, представленных сотнями и тысячами копий, и, наконец, много тысяч видов мРНК, каждый из которых содержится в клетке в количестве от 1до 10 копий. Так, например, в железистых клетках яйцевода, синтезирующих овальбумин и другие компоненты куриного белка, содержатся три вида мРНК: представленные в среднем 25 тыс. копий на клетку, еще 90 видов мРНК содержатся в клетке по 450 копий каждая и 24 тыс. генов функционируют так слабо, что в клетке содержится в среднем менее трех копий каждой такой мРНК. У морского ежа на стадии гаструлы 90 % всей мРНК представлено лишь всего 100 видами молекул (по 1000 копий каждой), а остальные 10 % составляют 10 тыс. видов мРНК по I–10 копий на клетку.

Итак, наряду с относительно небольшим числом активно работающих генов в эмбриональных и дифференцированных клетках большое число генов (может быть, все?) функционируют очень слабо, так что нельзя определить, синтезируется ли тот белок, который мог бы ими кодироваться. О возможной функции этих слабоактивных генов можно сделать несколько предположений, впрочем не исключающих друг друга. Может быть, некоторые виды ферментов или белковых структур в клетке нужны в таких небольших количествах, что для их синтеза достаточно и нескольких молекул мРНК. Таковыми, например, должны быть белки центриоли, которых в клетке всего одна или две. Может быть, это регуляторные белки, действующие на отдельные гены, и тогда их содержание в клетке или на хромосомах тоже измеряется десятками молекул. Например, у кишечной палочки нормальная концентрация одного из регуляторных белков всего 10 молекул на клетку. И наконец, можно предположить, что слабая функция генов не имеет никакого значения, а отражает некоторое несовершенство регуляторного аппарата, запирающего гены. Что‑то вроде неплотно прикрытых «подтекающих» кранов. Здесь опять напрашивается сравнение с хорошо изученными бактериями. У них ген в активном состоянии транскрибирует РНК в 1000 или даже в 10 000 раз быстрее, чем в неактивном, но это же означает, что и на неактивном гене происходит транскрипция одиночных молекул мРНК. Вместе с тем выше уже говорилось, что на разных стадиях развития животных количество слабо работающих генов различается. Оно уменьшается по ходу развития от 20–40 до 10–15 тыс., а в дифференцированных тканях падает до 2–3 тыс.

Метод гибридизации с ДНК отдельных генов позволяет оценить, как в ходе дифференцировки происходит накопление мРНК. Так, в клетках яйцевода молодых курочек содержится в среднем на клетку около одной молекулы мРНК овальбумина. После четырех ежедневных инъекций эстрадиола их становится 20 тыс., а через десять дней – 50 тыс. Если после этого инъекции прекратить, то количество молекул мРНК снова падает до пяти в одной клетке. Ho после однократной повторной инъекции гормона уже через 30 мин их становится 10, через час – 100, через три часа – 1000, а через сутки – 10 тыс. У взрослых кур мРНК синтезируются со скоростью около 30 молекул в минуту и половина их распадается приблизительно за сутки. При таком соотношении скоростей транскрипции и распада в каждой железистой клетке яйцевода курицы их накапливается более 100 тыс., что и обеспечивает интенсивный синтез овальбумина.

Этот пример показывает, что количество мРНК в клетке в равной мере зависит от скоростей их синтеза и распада и может регулироваться как той, так и другой величиной. Американский ученый Кафатос исследовал у бабочки павлиноглазки синтез особого фермента – коконазы, с помощью которого молодая бабочка растворяет стенку кокона и выходит из него. Оказалось, что мРНК коконазы в специальной железе вылупления образуется (транскрибируется) не быстрее многих других видов мРНК. Однако у большинства мРНК в клетках железы время жизни половины молекул 2,5 ч, в то время как для мРНК коконазы это время в 40 раз больше (100 ч). Только благодаря этому доля мРНК коконазы увеличивается от 8 % (от количества всей мРНК) в начале ее синтеза до 70 % через два‑три дня. В результате клетки железы почти целиком заполняются ферментным белком, который в нужный момент обеспечивает выход бабочки.

В начале развития мышц уже в эмбриональных миобластах начинает синтезироваться мРНК основного сократительного белка – миозина. Время полураспада этих мРНК 10 ч, и их количество в миобластах невелико. Ho когда миобласты сливаются друг с другом и начинают образовывать собственно мышцы, время жизни мРНК миозина увеличивается до 50 ч и резко увеличивается количество этих мРНК в молодых мышцах, в которых начинается быстрое накопление самого миозина.

Мы видим, что манипуляции с молекулами – методы молекулярной биологии и особенно методы генной инженерии – открыли совершенно новую главу в понимании проблем биологии развития. Молекулярный уровень этой науки, который казался самым недоступным, напротив, оказался более легким для изучения, чем, например, взаимоотношения более сложных систем – клеток и тканей. Успех молекулярных исследований показывает, что каждый новый шаг связан с развитием нового метода. Это, очевидно, должно стимулировать создание новых подходов и методов в тех направлениях биологии развития, которые пока отстают от молекулярных.

Глава IX

Изменяются ли гены в развитии?

Обсуждение этой проблемы началось, по‑видимому, с А. Вейсмана, который предположил, что при делении соматических клеток раннего зародыша «зародышевая плазма» (нынешняя ДНК) распределяется между дочерними клетками так, что в них попадают разные ее части – детерминанты (нынешние гены). В пользу этих представлений Вейсмана свидетельствовали наблюдения над потерей частей хромосом в соматических клетках во время первых делений дробления у аскариды. Сейчас, когда известно, что феномен утраты части генома аскариды и другие случаи явной потери генетического материала являются отнюдь не общим правилом, эти идеи Вейсмана имеют лишь исторический интерес.

Сегодня проблема, поставленная Вейсманом, может быть сформулирована иначе: происходят ли в ходе развития необратимые изменения в организации генетического материала и какое значение эти изменения, если они есть, имеют для механизмов развития? Уже первые опыты по разделению двух‑четырехклеточных зародышей амфибий и морского ежа на отдельные бластомеры и по получению из них полноценных зародышей показали, что в ходе делений генетический материал сохраняется в обеих дочерних клетках полностью и необратимо не изменяется. Далее Г. Шпеман подтвердил это остроумным опытом и для стадии 16 клеток. Если яйцо тритона перетянуть петлей не полностью, то делиться будет только одна половина, в которой оказалось ядро. На стадии 16 клеток одно ядро пропускали во вторую половину зародыша и

Затем перетягивали зародыш на две части полностью. И тот зародыш, который получил 15 ядер из 16, и тот, что получил только одно, образовали нормальных зародышей.

Эти опыты показали неверность гипотезы Вейсмана, но не могли осветить современный аспект проблемы: не происходят ли в ходе дифференцировки в ядрах необратимые изменения, ограничивающие их тотипотентность – способность обеспечить развитие целого зародыша, т. е. дифференцировку во всех направлениях? На стадии 16 клеток у амфибий дифференцировки еще нет. Для этого было необходимо испытать ядра на более поздних стадиях.

Дальнейшее развитие техники ядерных трансплантаций, как мы увидим, тоже не дало окончательного ответа на эти вопросы. Новые молекулярные методы дали в самые последние годы совершенно неожиданные результаты, однако вопрос еще далек от полного разрешения.

Трансплантация ядер

В 1953 г. американские ученые Бриггс и Кинг осуществили знаменательный эксперимент: из неоплодотворенного яйца лягушки было удалено собственное ядро и на его место пересажено ядро другого зародыша, взятое со стадии бластулы. Фактически трансплантировали всю клетку бластулы, но мембрана ее была разрушена всасыванием в тонкую пипетку, а ядро оставалось неповрежденным. Яйцо с ядром из бластулы в значительном проценте случаев начинало нормально делиться, образовывало зародыш, головастика и наконец лягушку. На всех этих стадиях часть животных погибала, но во многих случаях были получены взрослые нормальные лягушки, которые дали потомство. Техника пересадки была усовершенствована Гёрдоном, и процент удачных трансплантаций был повышен.

Однако, если брать ядра на более поздних стадиях – гаструлы, хвостовой почки и т. д., процент удачных опытов будет все более уменьшаться. Даже ядра из клеток кишечника головастика в некоторых случаях дали начало нормальному эмбриональному развитию. Сходный результат был получен, когда для пересадки использовали ядра из клеток опухоли и из клеток кожи взрослой лягушки, хотя в таких опытах далее головастика развитие не шло. Ядра, полученные из клеток разных тканей, сильно отличались по их пригодности к трансплантации. Ho в целом стало очевидно, что в ходе дифферёнцировки способность ядер давать начало нормальному развитию яйца падает.

Эти опыты были успешно повторены различными исследователями на разных видах амфибий. Однако ни в одном случае из ядер клеток взрослого животного не было получено ни одного взрослого животного. Поэтому если в начале шла речь о том, что на поздних стадиях ядра легче травмируются (и такие повреждения действительно часто обнаруживались), то сейчас очевидно, что одним этим объяснить неудачи нельзя.

Опыты на дрозофиле дали в принципе сходные результаты. Здесь ядра инъецировались в оплодотворенное яйцо, где в момент трансплантации происходили деления собственных ядер. Трансплантированные ядра со стадии бластулы, взятой от другой, иначе пигментированной линии мух, смешивались с собственными ядрами и участвовали в образовании различных органов, показывая тем самым свою тотипотентность. Более того, когда ядра бластулы попадали в заднюю часть яйца, они образовывали нормальные половые клетки, из которых получали мух той линии, чьи ядра были трансплантированы.

Однако, если в оплодотворенное яйцо трансплантировали ядра из клеток культуры тканей, участие этих ядер в образовании различных органов было существенно реже, чем при инъекции эмбриональных ядер. И в этом случае полученные мухи уже никогда не давали потомства с генетическими признаками трансплантированной линии, т. е. половые клетки из таких ядер не возникали. Это тоже свидетельствует о каких‑то ограничениях потенций.

Может быть, со временем дифференцированные ядра удастся каким‑то неизвестным пока образом перевести в менее дифференцированное состояние и тогда их трансплантация с поздних стадий или из клеток взрослого организма окажется успешной. В пользу такой возможности свидетельствуют неудачи трансплантации ядер из клеток зародышевого пути – мужских половых клеток на стадии сперматогоний, когда они еще не начали дифференцироваться в сперматозоиды. В этом случае генетический материал явно не имеет необратимых изменений. Поэтому неудачи легче объяснить техническими трудностями трансплантации, чем принципиальной невозможностью. Тем не менее проще допустить, что в ходе дифференцировкп в ядрах нарастают необратимые изменения.

Такой проблемы, по‑видимому, практически не существует у растений. Там из некоторых видов отдельных клеток взрослого растения удается выращивать целые растения. Этот результат может служить подтверждением отличий растений от животных: у растений многие клетки взрослого организма могут стать клетками зародышевого пути и давать начало новым поколениям.

Если действительно окажется, что у взрослого животного ядра дифференцированных клеток необратимо теряют способность к нормальному развитию, то значительно осложнится заманчивая идея о «клонировании людей», уже обыгранная фантастами и обсужденная с разных сторон учеными. Мы коснемся здесь только биологической стороны вопроса.

Для практического использования метода «клонирования людей» необходимо: а) трансплантировать ядра из клеток взрослого организма и получать нормальное развитие вплоть до взрослого организма; б) распространить эти опыты на млекопитающих: недавно поступили сведения, что после долгих усилий у мышей удалась трансплантация ядер, но пока только из ранних эмбриональных клеток; в) получить уверенность, что результаты всегда будут успешными. Тогда пересадка в безъядерную яйцеклетку человека ядра из клетки взрослого человека и возвращение такой яйцеклетки в женский организм привели бы к рождению ребенка, который генетически был бы однояйцовый близнец донора, от которого было получено ядро. Это означает, что не только внешний вид, но с большой вероятностью и умственные способности были бы тождественны или близки у донора и его «близнеца», который отличался бы от обычных близнецов лишь разницей в возрасте. Если все это оказалось бы так, то перед человечеством открылась бы возможность «повторять» отдельных гениальных ученых или деятелей искусства и даже увеличить их число в большом числе копий. Мы можем не касаться деталей и возникающих проблем – слишком все это пока фантастично. Ho если бы такая идея была осуществлена, это могло бы значительно повысить интеллектуальный и творческий потенциал всего человечества.