Стабильность дифференцировки и эпигенетическая наследственность

Факторы, вызывающие дифференцировку, обычно действуют короткое время, в то время как само дифференцированное состояние может сохраняться гораздо дольше. Например, нервная ткань у позвоночных возникает на ранних стадиях эмбрионального развития, а высокоспециализированные нервные клетки остаются в принципе неизменными на протяжении всей жизни. Практически не изменяются и очень многие другие типы клеток взрослого организма. То, что они за месяцы и годы не изменяют своей дифференцировки, что одни гены в них сохраняют свою активность, а другие так никогда и не начинают работать, требует объяснения. Должен существовать какой‑ то механизм стабильности этого, а не другого дифференцированного состояния.

Еще сложнее объяснить сохранение дифференцировки у делящихся клеток. В этом случае термин «наследственность» имеет все права, так как состояние дифференцировки поддерживается в ряду клеточных поколений и количество клеток – потомков одной дифференцированной – в ходе делений часто значительно возрастает. Даже в нервной ткани клетки, прежде чем они приобретут окончательно дифференцированное состояние и потеряют способность делиться, детерминируются, становятся нейробластами и проходят несколько клеточных делений. Печень как орган начинает дифференцироваться тоже очень рано. За время эмбрионального развития и последующего роста размер печени увеличивается в тысячи раз, т. е. составляющие ее клетки должны пройти не менее 10–15 клеточных делений, оставаясь все время клетками печени.

Клетки печени взрослого животного практически не делятся. Однако если в эксперименте удалить половину или две трети печени, то она в течение двух суток достигает прежних размеров, а ее клетки проходят одно‑два деления. Эта операция может быть повторена несколько раз. Клеточные деления можно вызвать также действием специфических ядов, приводящих к гибели значительной части клеток печени. Однако, проходя дополнительные деления, эти клетки остаются клетками печени, гепатоцитами, со всем комплексом их свойств: формой, активностью специфических ферментов и синтезом белков плазмы крови. Даже после злокачественного перерождения гепатоцитов в клетках гепатомы сохраняются многие признаки клеток печени, хотя перевиваемые или культивируемые in vitro клетки могут проходить сотни и тысячи делений. Выше мы уже рассказывали, что при соматической гибридизации клеток гепатомы крысы с фибробластами человека одно из свойств клеток печени – увеличивать синтез тирозинаминотрансферазы в ответ на действие стероидных гормонов – подавляется. Однако при утрате гибридами Х‑хромосомы человека это свойство возобновляется, т. е. много поколений клеток оно сохраняется, никак не проявляясь. Многие другие лабораторные линии опухолевых клеток, культивируемые в течение ряда лет, также сохраняют некоторые, хотя и не все свойства тех тканей, от которых произошли: синтез определенных белков, чувствительность к гормонам и т. д.

В условиях культуры тканей частично дифференцированные клетки могут долгое время размножаться, не приобретая окончательной дифференцировки. Так, например, будущие клетки мышц – миобласты – могут в культуре размножаться в течение нескольких лет. Ho при создании условий для дифференцировки – коллагеновой подложки и среды замедляющей деления, – миобласты сливаются друг с другом, образуют мышечные волокна, в них синтезируются миозин и другие мышечные белки. Естественно, что такой дифференцировке в мышцы могут подвергаться только миобласты, а не другие виды клеток. Следовательно, не только информация о свойствах миобласты, но и информация об активации генов миозина сохранилась и после сотен клеточных делений, хотя сами эти гены еще не функционировали.

Проблема состоит в том, как объяснить сохранение активности определенных генов у клеток, проходящих митотический цикл. За этот цикл хромосомы проходят два процесса, изменяющих их структуру, – репликацию и образование митотических хромосом (конденсацию хроматина). При образовании митотических хромосом происходит многократная спирализация и компактная укладка хроматиновой нити. Процесс транскрипции при этом прекращается. Необходимо, следовательно, объяснить, почему после завершения митоза, когда хромосомы деспирализуются, в них возобновляется активность тех же генов.

He менее сложно объяснить и поддержание стабильности дифференцнровки в процессе репликации. При удвоении ДНК возникают две двойные спирали, к которым присоединяются гистоны и негистоновые белки, образуя нуклеопротеидный комплекс – хроматин. Каким образом в этом случае активное состояние одного гена переходит в активное состояние двух генов в двух дочерних двойных спиралях ДНК? Иными словами, как удваивается, размножается, реплицируется не только сама ДНК, но и состояние избирательной активности в отдельных ее участках? К этим не решенным пока вопросам и сводится сейчас проблема стабильности дифференцнровки, или эпигенетической наследственности.

2. «Метаболическая» и «структурная» гипотезы

Группу «метаболических» гипотез составляют все те представления о природе стабильности, в которых фигурирует какое‑то активирующее вещество: оно может некоторое время находиться вне ДНК, но оно должно быть способно опознавать и активировать определенные гены, и в том числе тот ген, который определяет синтез самого этого вещества. Природа вещества не имеет принципиального значения, но, вероятнее всего, им может быть или РНК или белок. Согласно «метаболической» гипотезе, в дифференцированной клетке возникает замкнутый круг: на специальном гене транскрибируется мРНК, на этой мРНК транслируется белок, а этот белок активирует и «свой собственный» ген, и все другие гены, характерные для данной дифференцнровки.

Эта схема легко объясняет все трудности сохранения активности определенных генов в течение митотических циклов. Во время репликации ДНК и во время митоза ранее синтезированное активирующее вещество находится в цитоплазме, а после удвоения хромосом или после образования дочерних ядер вновь активирует те же самые гены, характерные для данной дифференцнровки (и в их числе и тот ген, активность которого пополняет в клетке запас активирующего вещества). Такая система, раз возникнув, далее поддерживает сама себя и уже не нуждается в тех факторах дифференцировки, которые ее однажды создали, т. е. запустили в менее дифференцированных клетках. Очевидно, что генов, определяющих синтез таких активирующих веществ, должно быть по меньшей мере столько, сколько типов дифференцированных клеток может быть в организме.

Никаких прямых доказательств «метаболической» гипотезы пока нет, но кандидатами на активирующие вещества могут быть и РНК, и негистоновые белки хроматина, о которых уже известно, что они участвуют в активации генов. Все как будто свидетельствует в пользу этой гипотезы, если бы не несколько случаев, которые очень трудно, а вероятно и невозможно объяснить с позиций «метаболической» гипотезы.

Вторую гипотезу можно назвать «структурной», потому что она не требует синтеза каких‑либо специальных веществ, но предполагает изменения в структуре ДНК или всего хроматина. Согласно этой гипотезе, при возникновении дифференцировки в структуре генов и хроматина происходят такие изменения, которые делают эти гены активными. Изменения в структуре, раз возникнув, способны «помнить» о своей активности и сохраняться во время таких сложных процессов, как образование метафазных хромосом при делении клетки. Более того, эти особенности структуры должны во время репликации распространяться на обе двойные спирали ДНК.

Согласно нашим сегодняшним знаниям о природе хроматина, таким требованиям надежно удовлетворяют только изменения в первичной структуре ДНК, т. е. замена одних нуклеотидов другими или перемещения более крупных участков ДНК. Такие изменения (замены или перемещения), если они возникли, естественно, сохраняются в митозе, а при репликации ДНК оказываются в обеих новообразованных хромосомах, т. е. удваиваются. До сих пор, однако, неизвестно, существуют ли в дифференцированных клетках, кроме лимфоцитов, изменения в первичной структуре ДНК, и если да, то каков механизм их возникновения и обратимы ли они?

Значительно труднее представить сохранение и удвоение изменений не в виде последовательности нуклеотидов ДНК, а в конфигурации ее двойной спирали (вторичная структура ДНК) или в ее связях с белками, хотя такие гипотетические схемы существуют. И тем не менее, хотя представить себе «структурную» гипотезу значительно сложнее, чем «метаболическую», некоторые факты легче объяснить первой, чем второй.

3. Факты, не согласующиеся с «метаболической» гипотезой

Прежде всего мы обсудим явление, открытое английской исследовательницей М. Лайон, которое получило название «лайонизация Х‑хромосомы». Как известно, самки млекопитающих имеют две Х‑хромосомы, в то время как самцы – только одну. Х‑хромосома несет много важных генов, и, очевидно, должен быть механизм, который бы как‑то уравнивал количество генетической продукции (мРНК) в мужских и женских клетках. Оказалось, что у ранних зародышей млекопитающих на стадии 100–400 клеток происходит инактивация одной из Х‑хромосом, которая образует компактный высокоспирализованный комочек, т. е. становится гетерохроматином. Эту компактную глыбку, так называемое тельце Барра, можно видеть только в ядрах клеток женского организма. Возможность определить пол, в идеале по одной клетке, уже используется в судебной медицине, а также в спорте для подтверждения пола у женщин‑спортсменок. В ближайшем будущем этот метод будет использоваться для прижизненного определения пола у эмбрионов человека в первые месяцы беременности. Развитие этого метода позволит в перспективе регулировать пол потомства (путем отказа от продолжения беременности при нежелательном варианте).

Гетерохроматизация, или «лайонизация», одной из Х‑хромосом происходит в каждой эмбриональной клетке случайно, но затем во всех потомках этой клетки гетерохроматинизированной остается та же самая хромосома. Если обе Х‑хромосомы не идентичны, т. е. некоторые гены у них представлены разными аллельными вариантами, то весь организм становится мозаичным: в одних клетках работают одни варианты генов, а в других – другие мутантные варианты. Возникает вопрос: каким образом после того, как данная Х‑хромосома гетерохроматинизировалась, она, вернее, ее потомки подвергаются такому же процессу снова и снова, после каждого митоза? Ведь в митозе обе Х‑хромосомы суперспирализованы (компактизованы) одинаково и не отличаются друг от друга.

В чистых линиях животных обе Х‑хромосомы совершенно одинаковы, и невозможно себе представить, чтобы какое‑либо вещество отличило одну Х‑хромосому от другой. Следовательно, лайопизированная Х‑хромосома даже в метафазе митоза как‑то «сама помнит» о своей лайонизации и возобновляет ее снова после митоза. Единственное разумное объяснение этому явлению состоит в том, что в действительности структура однажды лайонизированной Х‑хромосомы становится в чем‑то отличной от другой, но это отличие не удается заметить во время митоза и оно способно передаваться при репликации обоим потомкам данной Х‑хромосомы.

Второй пример, который мы рассмотрим, также касается функционирования Х‑хромосом у самцов и самок. Ho на этот раз речь идет о дрозофиле, у самок которой обе Х‑хромосомы остаются активными. Компенсация дозы гена у них достигается иным путем: единственная Х‑хромосома самца в клетках дрозофилы функционирует вдвое активнее, чем в клетках самок, т. е. на ней одной транскрибируется столько же РНК, сколько на двух Х‑хромосомах самки. Р. Б. Хесин и Б. А. Лейбович в нашей стране получили препараты политенных хромосом из клеток слюнных желез самцов и самок. Распластанные на стекле и обработанные смесью спирта и уксусной кислоты, эти хромосомы были лишены не только всех белков цитоплазмы, но и части белков самих хромосом. Для того чтобы обнаружить активность этих хромосом, к ним добавляли бактериальную РНК‑полимеразу и радиоактивные предшественники синтеза РНК. Оказалось, что и в этих условиях, хотя порядок транскрипции нарушался (из‑за использования чужеродной РНК‑полимеразы), на Х‑хромосоме самца РНК синтезировалась вдвое интенсивнее, чем на каждой из двух Х‑хромосом самок. И в этом случае «метаболическая» гипотеза оказывается бессильной. Так как все растворимые метаболиты клеток отсутствовали, то Х‑хромосомы самца и самки могли отличаться только структурно. При этом, правда, нельзя исключить, что какие‑то специфические белки, ответственные за интенсивность транскрипции, сохраняются на хромосомах.

Таким образом, несмотря на всю привлекательность и простоту «метаболической» гипотезы, существуют некоторые факты (мы привели только два из них), которые с ней никак не согласуются. Это заставляет нас искать какие‑либо разумные варианты структурной гипотезы.

Варианты структурной гипотезы

Итак, несколько экспериментальных данных говорят о возможности таких структурных изменений, которые сохраняются при митозе и при репликации, могут передаваться в ряду клеточных поколений и обеспечивают эпигенетическую наследственность и стабильность дифференцировки.

Наиболее простым объяснением структурных изменений в хромосомах является возможность изменения первичной структуры ДНК. Если такие изменения происходят в обеих или даже в одной из двух цепей ДНК, то естественно, что далее они передаются путем обычной репликации всем потомкам той клетки, в которой эти изменения в первый раз произошли. Ho половыми клетками эти клетки уже стать не могут, или надо предусмотреть механизм, восстанавливающий первоначальную первичную структуру ДНК.

В литературе существует несколько гипотетических схем, объясняющих, как мог бы в ходе развития в результате действия определенных ферментов один нуклеотид, оставаясь в составе ДНК, превратиться в другой. И действительно, в отдельных работах такие изменения были отмечены, хотя механизм и молекулярная природа этих изменений неясны, да и сами факты требуют подтверждения. Кроме того, изменения в отдельных нуклеотидах так незначительно сказываются на общем составе ДНК, что заметить их обычными методами невозможно.

Существует еще один путь изменения ДНК – это ее модификация посредством метилирования. В клетке известен особый класс ферментов – метилазы, которые присоединяют CH3‑группу к некоторым цитозиновым основаниям ДНК. Метилируются далеко не все цитозины, и доступность метилазам зависит от окружающих нуклеотидов. А это означает, что метилирование может быть достаточно специфичным. И действительно, есть данные, показывающие, что метилирование ДНК заметно выше в неактивных генах. Вместе с тем есть и менее специфичные метилазы, которые метилируют цитозин, лежащий вблизи метилцитозина, но на другой нити ДНК. Это создает возможность сохранения метилирования во время репликации. При образовании двух новых двойных спиралей ДНК старая нить в них сохранит метильные группы. Ho малоспецифическая метилаза тут же восстановит метилирование и на другой нити.

Факты самых последних лет подтверждают эти представления: содержание метилцитозина намного ниже в активных генах в клетках многих животных. Более того, подтвержден и механизм репликации метилированных состояний, т. е, поддержания метилированных оснований в ряду клеточных поколений. Однако получены и другие факты: в ядрах дрозофилы ДНК оказалась совершенно неметилированной.

Если изменения первичной структуры ДНК путем замещения отдельных нуклеотидов остаются проблемой и, во всяком случае, требуют подтверждений, то изменения путем переноса больших участков ДНК и, может быть, потери некоторых последовательностей определенно доказаны. В последнее время обнаружено, что в развитии дрозофилы происходит, по‑видимому, случайный перенос участков ДНК в другие части хромосомы, что сказывается на проявлении действия генов. Ho наиболее убедительными являются изменения строения генов иммуноглобулинов, для которых было показано, что при дифференцировке лимфоцитов происходит закономерное сближение нескольких районов ДНК. Подробнее мы рассмотрим этот вопрос в следующей главе. Если такие переносы или делеции показаны для одних случаев дифференцировки, то мы вправе ожидать, что и в других случаях события такого порядка тоже возможны.

Среди структурных механизмов эпигенетического наследования можно говорить также о «недо‑ и перерепликации» ДНК. Известно, что при образовании политенных хромосом у насекомых некоторые их участки реплицируются меньшее число раз, чем остальные части хромосом. Наоборот, при амплификации ДНК в ооцитах группа рибосомных генов реплицируется избирательно. Возможность подобных явлений позволяет предположить и такие способы изменения генома. Изменения «высших» структур ДНК, т. е. изменения характера ее спирализации или укладки в хромосоме, изменения характера связи ДНК с белками и т. д., также могут выдвигаться в качестве эпигенетических механизмов. Так, в ряде работ болгарского ученого Цанева и американца Вайнтрауба обсуждаются возможности сохранения в процессе репликации ДНК особенностей строения нуклеосом. Авторы этих гипотез предполагают, что местные модификации гистонов путем, например, их фосфорилирования или ацетилирования (такие модификации гистонов действительно происходят при активировании репликации или транскрипции) могут передаваться на обе вновь образующиеся молекулы ДНК и таким образом размножать раз созданные отличия гистонов, лежащих в районе того или иного гена. Эти представления, однако, встречают пока много трудностей и не получили еще надежного экспериментального подтверждения.

Мы можем заключить эту главу приблизительно тем же, с чего она началась. Эпигенетическая наследственность, или, иначе, сохранение дифференцировки в ходе клеточных делений, – факт, требующий своего объяснения. Несмотря на всю привлекательность «метаболических» гипотез, они не могут объяснить ряд фактов, что заставляет прибегать к созданию гипотез о «структурном» механизме эпигенетического наследования. И хотя сегодня мы не располагаем надежными экспериментальными данными о «структурных» механизмах такого наследования (что верно и для «метаболических» гипотез), некоторые гипотезы об изменении структуры ДНК не кажутся совсем невероятными.

Глава XI

Стволовые клетки

Дифференцированные клетки взрослого организма отличаются одна от другой не только строением и функциями. Они отличаются и временем жизни. Некоторые из них, например нервные, обычно живут столько, сколько живет сам организм. Клетки крови или эпителия кожи существуют значительно меньше – их время жизни измеряется неделями или месяцами. Наконец, эпителиальные клетки кишечника сохраняются не более одного‑двух дней.

Если почему‑либо погибают нервные клетки (например, при мозговой травме), их уже невозможно восстановить: нервные клетки, как известно, не делятся. При потере части клеток печени (это бывает не только при хирургическом удалении доли печени, но и при некоторых тяжелых отравлениях и болезнях) происходит полное восстановление нормального числа клеток за счет деления оставшихся. В отличие от нервных клеток дифференцированные клетки печени сохраняют полную способность к делениям, хотя в норме почти не делятся.

Поддержание постоянного количества дифференцированных клеток крови, таких, например, как эритроциты, за счет деления их самих совершенно невозможно. У млекопитающих эритроциты вообще лишены ядра, но и ядерные эритроциты у других позвоночных настолько специализированны, что необратимо потеряли способность к делению. Также не способны делиться наполненные кератином клетки поверхностных слоев эпителия кожи и обращенные в полость кишки клетки, лежащие на концах ворсинок. Поддержание нормального числа специализированных клеток во всех этих случаях, а также во многих других происходит путем их постоянной дифференцировки из менее дифференцированных делящихся клеток. В различных органах содержится запас таких малодифференцированных клеток. Некоторая их часть дифференцируется и при этом теряет способность к делению, а часть делится и этим поддерживает постоянное число малодифференцированных клеток.

Если эти процессы изобразить схематически, они будут выглядеть, как дерево с прямым стволом и боковыми ветвями. Ствол – это ряд непрерывно делящихся малодифференцированных клеток, а боковые ветви – это клетки, вступившие на путь дифференцировки и после нескольких делений превращающиеся в полностью дифференцированные клетки, которые через некоторое время погибают. Эта схема привела к термину «стволовые клетки», которым и называют малодифференцированные клетки, способные к делению и к дифференцировке в одном или нескольких направлениях. Раньше в этих случаях обычно использовали ботанический термин – «камбиальные клетки».

Внешне стволовые клетки трудно или даже невозможно отличить от других малодифференцированных клеток, уже начавших свою дифференцировку. В случае эпителия кожи или кишечника эта задача решается проще и не требует специальных методов.