Аппаратура для конечной стадии биотехнологических производств и получения готового продукта

Завершающая стадия биотехнологического процесса – выделение целевого продукта. Эта стадия существенно различается в зависимости от того, накапливается продукт в клетке либо выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является сама клеточная масса. Наиболее сложно выделение продукта, накапливающегося в клетках. Для этого клетки необходимо отделить от культуральной жидкости, разрушить (дезинтегрировать) и далее целевой продукт очистить от массы компонентов разрушенных клеток.

Первым этапом на пути к очистке целевого продукта является разделение культуральной жидкости и биомассы – сепарация. Существуют различные методы сепарации:

1) флотация, если клетки продуцента в биореакторе из-за низкой смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях жидкости;

2) фильтрация на пористой фильтрующей перегородке;

3) центрифугирование. Метод основан на осаждении взвешенных в жидкости частиц с применением центробежной силы. Ценрифугирование требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование. Поэтому оно оправдывает себя, если: а) суспензия фильтруется медленно; б) поставлена задача максимального освобождения культуральной жидкости от содержащихся частиц; в) необходимо наладить непрерывный процесс сепарации в условиях, когда фильтры рассчитаны только на периодическое действие.

Центрифугирование и фильтрация в некоторых производственных процессах реализуются в комбинации – речь идет о фильтрационных центрифугах. Широко применяют центрифуги, где разделение жидкой и твердой фаз не связано с фильтрацией и основано лишь на центробежной силе.

Следующим этапом получение целевого продукта является разрушение клеток. Разрушение клеток (дезинтеграцию) проводят физическим, химическим и химико-ферментативным методами. Наибольшее индустриальное значение имеет физическое разрушение: ультразвуком; с помощью вращающихся лопастей или вибраторов – метод, обычно используемый в пилотных и промышленных установках; встряхиванием со стеклянными бусами; продавливанием через узкое отверстие под высоким давлением; раздавливанием замороженной клеточной массы; растиранием в ступке; осмотическим шоком; замораживанием – оттаиванием; сжатием клеточной суспензии с последующим резким снижением давления (декомпрессия).

За дезинтеграцией клеток следует этап отделения фрагментов клеточныхстенок. Используют те же методы, что и при сепарации клеток: центрифугирование или фильтрацию. Однако применяют более высокоскоростные центрифуги и фильтры с меньшим диаметром пор (часто мембранные), чем при сепарации клеток. Выделение целевого продукта из культуральной жидкости или гомогената разрушенных клеток проводят путем его осаждения, экстракции или адсорбции.

Современные методы разделения веществ включают: хроматографию, электрофорез, изотахофорез, электрофокусировку, основанные на принципах экстракции и адсорбции.

Разделение веществ путем хроматографии связано с их неодинаковым распределением между двумя несмешивающимися фазами. Различают хроматографию на бумаге, пластинках, колонках. При хроматографии на бумаге или на пластинках одной из несмешивающихся фаз служит движущийся растворитель, например бутанол, а другой, неподвижной, фазой – волокна бумаги или частицы покрывающего пластинку силикагеля или другого материала. При колоночной хроматографии подвижная фаза – текущий через колонку растворитель, неподвижная – заполняющий колонку адсорбент, чаще всего гранулированный гель. Разделяемая смесь вводится в контакт с подвижной и неподвижной фазами. Колоночная хроматография допускает масштабирование – увеличение размеров и пропускной способности. Она применяется в промышленных условиях и имеет несколько разновидностей.

Ионообменная хроматография – гранулы адсорбента, например карбоксиметилцеллюлозы, несут на себе заряженные группы, катионные (NH₄⁺), анионные (SO₃^-2), способные к захвату ионов противоположного знака. Она применяется для выделения ионизированных соединений из жидкости, а также для очистки нейтральных соединений от примесей ионной природы.

Метод «молекулярных сит», гель-хроматография, гель-фильтрация.

Хроматография, основанная на разделении веществ с различной молекулярной массой и диаметром. Частицы адсорбента захватывают и удерживают, скажем, только низкомолекулярные соединения, пропуская высокомолекулярные.

Аффинная хроматография – задерживается компонент, образующий прочный комплекс с лигандом, фиксированным на частицах носителя. Применяют агенты, специфически связывающие одно индивидуальное вещество. Например, фермент очищают путем связывания на колонке, несущей субстрат или специфический ингибитор. Аффинная хроматография может обеспечить полную очистку продукта из сложной многокомпонентной смеси – культуральной жидкости, экстракта клеток – в одну стадию, в то время как более традиционные методы осаждения и ионообменной хроматографии требуют многоэтапной очистки, сопряженной с большими затратами труда и времени.

Наряду с аффинной хроматографией, называемой также аффинной адсорбцией в геле, для крупномасштабного отделения и очистки продуктов биотехнологических процессов предполагают применять аффинную преципитацию и аффинное разделение. При аффинной преципитации лиганд прикрепляют к растворимому носителю. При добавлении смеси, содержащей соответствующий белок, образуется его комплекс с лигандом, который выпадает в осадок сразу после его формирования или после дополнения раствора электролитом. Аффинное разделение основано на применении системы, содержащей два водорастворимых полимера. Один из полимеров, например полиэтиленгликоль, несет специфические лиганды. Другой полимер, например высокомолекулярный декстран, обладает сродством к остальным, примесным компонентам. Аффинное разделение представляет собой наиболее высокоэффективный из аффинных методов очистки.

Лекция 1