Кинетика ферментативных реакций
Рассмотрим самую простую реакцию превращения субстрата (S) в продукт (Р) при участии фермента (Е).
Уже в ранних работах было обнаружено, что начальная скорость ферментативной реакции при фиксированной концентрации фермента и малых концентрациях субстрата изменяется линейно с концентрацией субстрата, но для высоких концентраций субстрата скорость реакции уже не зависит от концентрации субстрата.
Л. Анри (1903 г.) первым предложил идею, что фермент образует с субстратом промежуточный комплекс. Развил эту идею Л. Михаэлис.
Согласно этой идеи, механизм процесса можно представить состоящим из двух стадий. Первая обратимая и быстрая, вторая – необратимая и медленная:
Для данного механизма скорость реакции определяется скоростью образования продукта реакции Р:
v . (5.36)
Скорость образования промежуточного продукта ES, равна:
. (5.37)
Уравнения материального баланса для фермента и субстрата имеют вид:
и , (5.38)
где и – начальные концентрации фермента и субстрата, и – их текущие концентрации, –концентрации промежуточного соединения и продукта реакции.
Решение системы из трех уравнений(5.36 – 5.38) находим из следующих условий:
1) для , , следовательно, ;
2) обычно >> (или ) , поэтому ;
3) считают, что концентрация промежуточного соединения стационарна (на основе принципа стационарности Боденштейна), т.е. .
Подставляя значение из (5.38) в (5.36) и решая его относительно при условии , получим
. (5.39)
Поделим числитель и знаменатель этого уравнения на , тогда имеем:
. (5.40)
Величину принято называть константой Михаэлиса.
Подставляя уравнение (5.40) в (5.36), получим уравнение для скорости образования продукта в начальный момент времени:
. (5.41)
Анализ уравнения (5.41) позволяет объяснить наблюдаемые на опыте закономерности:
1) если КМ>> , тогда
, (5.42)
то есть начальная скорость линейно зависит от концентрации субстрата. Этот факт полностью подтверждается экспериментальными данными;
2) если >>КМ, тогда из уравнения (5.41) получаем
, (5.43)
то есть начальная скорость не зависит от концентрации субстрата, что так же соответствует опытным данным. Следовательно, порядок реакции по субстрату в этом случае будет нулевой, а скорость процесса достигает максимального значения. Поэтому уравнение (5.41) можно записать в виде:
. (5.44)
Уравнение (6.44) в литературе известно как уравнение Михаэлиса – Ментена. КМ называется константой Михаэлиса, физический смысл которой можно сформулировать, анализируя уравнение (5.44).
Константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата ( ), при которой активность фермента составляет половину максимальной, т.е. . Константой Михаэлиса имеет размерность концентрации, моль/л. Численные значения КМ обычно лежат в пределах 10-2 – 10-8 М, легко воспроизводятся и не зависят от концентрации фермента. В то же время КМ является функцией температуры, рН среды, зависит от присутствия других веществ, играющих роль ингибитора или активатора.
Если для рассматриваемого механизма реакции выполняется условие: >> , тогда , где - субстратная константа, т.е. константа диссоциации фермент–субстратного комплекса на фермент и субстрат, характеризующая меру связывания фермента с субстратом. В общем случае , причем экспериментальное значение представляет собой максимальное значение .
Только для ферментов разложения пероксида водорода, каталазы и пероксидазы, для которых << , константа Михаэлиса сильно отличается от субстратной константы .
Величину (размерность t-1) называют также числом оборотов фермента, так как она указывает на число моль субстрата, превращенных в продукт одним молем фермента в единицу времени. Для сложных реакций константу в уравнении Михаэлиса – Ментена обычно заменяют на – каталитическую константу с той же размерностью.
Для определения параметров и используют несколько способов лионеризации уравнения Михаэлиса – Ментена.
1. Первый способ (способ Лайнуивера – Берка).
Уравнение (5.44) приводят к виду:
. (5.45)
График прямой, построенной в координатах , отсекает отрезок на оси ординат, равный . Тангенс угла наклона прямой равен . Как следует из уравнения (5.45), константу можно определить по отрезку, отсекаемому прямой на оси абсцисс, так как при имеем соотношение:
, (5.46)
откуда .
2. Второй способ (вторая форма уравнения Лайнуивера – Берка).
Уравнение (5.45) умножают на :
. (5.47)
График в координатах , представляет собой также прямую, отсекающую на оси ординат отрезок, равный , а на оси абсцисс отрезок, равный – .
3. Третий способ (способ Эдди - Хофсти).
Если умножить обе части уравнения (5.45) на ( ), то оно приводится к виду:
. (5.48)
График, построенный в координатах ( ), дает прямую линию, тангенс угла наклона которой равен , а отрезок, отсекаемый на оси ординат равен . Кроме того, как видно из рис. 2, отрезок, отсекаемый на оси абсцисс равен , так как при или .
Указанные способы лианиризации уравнения Михаэлиса – Ментена охватывают различные области концентрации субстрата, когда возможны отклонения от линейности. Поэтому полезно значения , определенные различными способами, сравнивать между собой.
Нетрудно показать, что аналогичная (5.45) форма уравнения может быть получена и для более сложных механизмов реакции. Например, когда субстрат взаимодействует с ферментом по схеме:
.
Выражение для начальной скорости в этом случае имеет вид:
, (5.49)
где . Это уравнение аналогично по форме уравнению Михаэлиса – Ментена и также легко линеаризуется.
Возможно протекание более сложных ферментативных реакций с участием двух субстратов.
Дата добавления: 2016-01-09; просмотров: 1016;