Методы диагностики вирусных болезней

Визуальная диагностика. Хотя в ряде случаев и удается достоверно установить вирусную природу заболевания по внешним признакам (например, кольцевые или линейные хлоротичные узоры на молодых листьях), их идентификация затруднена в связи с бессимптомным (латентным) характером развития болезней. Симптоматика зависит от состояния организма, агрессивности штамма патогена, внешних условий и продолжительности пребывания вируса в клетках хозяина. Например, симптомы заболевания отчетливо выражены у растений, росших на ярком свету и при умеренной температуре, при высокой температуре и недостаточном освещении симптоматика заболевания может быть совсем не выражена.

Посветление жилок самых молодых листьев нередко является одним из первых признаков системной вирусной инфекции. Жилки становятся желтыми и полупрозрачными. Листья, образующиеся позже, могут быть мозаичными, крапчатыми или совсем желтыми (хлоротичными).

Инкубационный период заболевания зависит от вида вируса, растения хозяина и условий среды, но, в любом случае, он составляет несколько дней или недель.

Если первые симптомы вироза заметны на рассаде, то источник инфекции находился либо в семенах, либо заражение произошло при посредстве переносчика. Если зараженные растения расположены в культуре совершенно случайно или же только в рядках, посаженных из одной партии, то это говорит о том, что, скорее всего, был заражен посадочный материал. Если на отдельных участках поля обнаруживаются заболевшие растения, причем появление зараженных участков связано с почвенными различиями, имеются все основания предполагать распространение вирусов через почву.

Хотелось бы отметить также, что существуют симптомы, напоминающие поражения вирусами, но вызванные другими причинами. Сходные симптомы поражения имеют фитоплазмы и некоторые бактерии. Точечные некрозы, вызванные поражениями растений тлями и клещами, также нередко путают с вирозами, например, большая картофельная тля вызывает скручивание, деформацию и местный хлороз листьев огурца. К появлению симптомов, сходных с вирусной инфекцией, часто приводят обычные нарушения минерального питания (например, связанные с дефицитом железа). Различные деформации органов могут вызывать гербициды гормональной природы.

Таким образом, точная идентификация по внешним признакам поражения вирусами невозможна, однозначный ответ может быть получен только с использованием инструментальных методов (иммуноферментный анализ, PCR-анализ и т.д.).

Метод индикаторных растений является широко распространенным методом диагностики вирусных болезней и идентификации вирусов. Он основан на использовании тест-растений (индикаторных), дающих четкие, часто строго специфичные по отношению к определенному виду вируса, симптомы. Заражение травянистых растений-индикаторов осуществляют механической инокуляцией соком. Заражение проявляется в виде местных некрозов, реже системной реакцией (изменением окраски, угнетением роста). Для вируса аспермии томата в качестве индикатора можно использовать молодые растения табака (Nicotiana glutinosa), для диагностики Х-вируса картофеля – амарант шаровидный (Gomphrena globosa). В ряде случаев для заражения можно использовать отдельные изолированные листья растений-индикаторов. Соконепереносимые вирусы переносят на индикаторные растения методом прививки, так для диагностики вирусов земляники используют прививку черешком листа на индикаторные клоны земляники лесной (Fragaria vesca). Редко для передачи вирусов используют насекомых–переносчиков и растение-паразит повилику.

Серологическая диагностика. Если теплокровному животному ввести в кровь очищенный препарат растительного вируса, иммунный аппарат животного в ответ на введение чужеродного белка (антигена) начнет вырабатывать специфические к нему антитела, связывающие антиген. В результате реакции образуется осадок (преципитат, или серум), различимый визуально или с помощью микроскопа.

Практическое значение для идентификации вирусов в растении имеют следующие модификации:

1. Капельный метод, при котором на предметном стекле каплю антисыворотки смешивают с каплей сока растения, и через несколько минут оценивают реакцию под микроскопом при малом увеличении в тёмном поле или даже визуально без микроскопа.

2. Для определения сферических и других мелких вирусов используют метод двойной диффузии в агаровом геле. При этом в одни лунки, вырезанные в слое агаровой среды, добавляют антисыворотку, а в другие очищенный сок растения. Антитела и вирусные частицы диффундируют в геле навстречу друг другу и образуют в месте встречи отчетливые линии преципитации.

3. При использовании метода радиальной иммунодиффузии антисыворотку добавляют непосредственно в агаровую среду, а лунки заполняют соком, в случае положительной реакции вокруг лунок образуются преципитаты в форме колец.

4. Метод адсорбции основан на том, что перед реакцией с антигеном антитела связывают каким-либо инертным материалом с крупными частицами, например, латексом. При реакции с антигеном происходит хорошо заметная агглютинация всего комплекса.

5. Наиболее высокочувствительной, позволяющей получать количественные оценки модификацией является иммуноферментный анализ (ИФА), основанный на связывании антител определёнными метками — ферментами. В лунки микроплаты из полимерных материалов добавляют антисыворотку и очищенный сок, содержащий антитела, между ними происходит первая иммунная реакция. Затем на фиксированный комплекс антиген-антитело наносят раствор антител, связанных ферментом (фосфатаза или пероксидаза), при этом меченные ферментом антитела наслаиваются на детерминанты молекул антигена, и происходит вторая иммунная реакция. После добавления соответствующего ферментного субстрата происходит ферментная реакция по каталитическому расщеплению субстрата, что обнаруживается с помощью фотометра по цветной реакции.

Метод электронной микроскопии. С помощью электронных микроскопов в ультратонких срезах поражённых частей растений можно установить форму, строение и даже размеры вирусов. Трансмиссионный электронный микроскоп используют для серийных анализов вирусной инфекции в соке иммуноэлекгронной микроскопией, при которой можно обнаруживать вирусные частицы с наслоившимися антителами.

Метод гель-электрофореза. Этот метод основан на электрофоретическом разделении предварительно очищенных нуклеиновых кислот вируса (вироида) или его белкового компонента в геле при силе тока 3 и 6 мА с окрашиванием зон соответственно нуклеиновых кислот или белков. При сравнении полученных окрашенных линий с высотой стандартных маркерных зон определяют массу (соответственно и размеры) вирусных структур.

Метод ДНК-зондов основан на принципе комплементарности нуклеиновых кислот. Синтезируют зонды, которые узнают определённые нуклеотидные последовательности РНК вируса. В зависимости от выбора зондов можно дифференцировать группы, виды и даже штаммы вирусов.

Молекулярно-биологический метод основан на знании строения молекулы РНК вируса. Наиболее распространённым тестом является амплификация (умножение) видоспецифичных последовательностей РНК в ходе полимеразной цепной реакции (PCR). При этом отдельные фрагменты РНК, специфичные только для одного вида или группы родственных вирусов, многократно с помощью ферментов размножают, при этом их количество превышает исходное число копий выбранного фрагмента РНК в миллионы раз. Далее их обнаруживают методом электрофореза в геле или методом иммунофлуоресценции.

Частные методы исследований. Метод включений. Развитие некоторых вирусов в клетках растения сопровождается образованием в ней скопления вирусных частиц (включений, кристаллов Ивановского), которые обнаруживаются с помощью обычного светового микро скопа. Каждому виду вируса свойственна своя форма вирусных включений, образующихся обычно в клетках волосков или эпидермиса листьев. Например, для вируса табачной мозаики характерны игловидные и гексагональные кристаллы; для Х-вируса картофеля типично образование сферических аморфных тел.

Для выявления зелёной крапчатой мозаики огурца, скручивания листьев картофеля и некоторых других применяют химические аналитические методы диагностики.