Псевдокинетические методы измерения (двухточечная кинетика).

Здесь также определяется скорость изменения оптической плотности по времени реакции, только здесь измеряется оптическая плотность в начале интервала измерения (после ЛАГ-фазы) и в конце. Измерение двухточечное (псевдокинетика). При этом способе оптическую плотность определяют на линейном участке кинетической кривой дважды, четко фиксируя интервал времени между измерениями. Этот способ используют, например, в современных методах определения активности a-амилазы на основе блокированных мальтоз и щелочной фосфатазы.

ОБРАБОТКА КЮВЕТ

Во многих лабораториях для дезинфекции фотометрических кювет и многоразовых пробирок применяются различные растворы, содержащие перекись водорода. Недостаточно тщательное ополаскивание после применения таких растворов приводит в получению ложно завышенных результатов при проведении методик основанных на пероксидазной реакции (метод Триндера). В их число входят наборы, предназначенные для определения концентрации общего холестерина, ЛПВП-холестерина, ЛПНП-холестерина, триглицеридов, глюкозооксиданый метод определения глюкозы, мочевой кислоты, молочной кислоты. При подготовке к выполнению данных методик необходимо быть уверенным в чистоте кювет и пробирок от остатков перекиси водорода. Пробирки, особенно пластиковые, лучше вообще использовать одноразовые, не моя их для повторного использования. Это, к сожалению, весьма распространенная практика, а пластик (в отличие от стекла) имеет довольно высокую пористость, и отмыть его от дезинфицирующего или моющего раствора полностью практически невозможно.

САХАРНАЯ МОЧА

Распространенной ошибкой является определение глюкозы в моче глюкозооксидазным методом. Дело в том, что кетоновые тела и ацетоновые тела, содержащиеся в моче при ряде патологий, попав в реакционную смесь глюкозооксидазного метода, дают красную окраску. В итоге в моче определяется не содержание глюкозы, а сумма кетоновых тел, ацетоновых тел и глюкозы. Для определения глюкозы в моче следует использовать референтный гексокиназый метод. Да, он дороже, но им определяется только глюкоза.

Энзиматические методы отличаются наиболее высокой специфичностью, связанной со свойствами используемых ферментов (глюкозооксидазы и гексокиназы). Глюкозооксидазе для окисления субстрата (глюкозы) требуется кислород воздуха. Побочным продуктом измерительной реакции является пероксид водорода; в индикаторной реакции он расщепляется пероксидазой. При этом присутствующий в среде реакции хромоген (система 4-аминоантипирин+фенол или др.) окисляется и приобретает розовую окраску, интенсивность которой определяется колориметрически. Основные погрешности метода связаны как с постепенным "старением"компонентов при хранении (окисление субстратов, потеря активности ферментов; из-за этого необходима периодическая подкалибровка), так и с "затратой" части пероксида водорода на окисление присутствующих в сыворотке восстанавливающих веществ (из-за этого показания несколько занижаются).

Схема реакций глюкозооксидазного метода:

глюкозооксидаза глюкоза + О2 ---------------------> глюконовая кислота + Н2О2 пероксидаза Н2О2 + хромоген --------------> Н2О + окисленный окрашенный хромоген

Достоинства

Специфичность, отсутствие влияния антикоагулянтов

Простота анализа (конечная точка, монореагент)

Доступность и невысокая стоимость реактивов

Недостатки Снижение активности ферментов при хранении (нужна периодическая калибровка)

Необходимость предварительной депротеинизации (при анализе цельной крови) Возможность некоторого занижения результатов из-за неспецифичности пероксидазы (окисление всех редуцирующих веществ)

Указанных недостатков во многом лишен гексокиназный метод, основанный на фосфорилировании глюкозы ферментом гексокиназой в присутствии АТФ. Обра-зующийся глюкозо-6-фосфат в индикаторной реакции окисляется специфической дегидрогеназой с образованием восстановленного кофермента НАДФН и соответствующим возрастанием экстинкции при 340 нм (оптический тест Варбурга). Недостатки гексокиназного метода в основном связаны с его технологией: необходим фотометр с ультрафиолетовым диапазоном и возможностью кинетических измерений; реагенты относительно дороги. Тем не менее указанный метод считается референтным, т.к. из общедоступных он дает наиболее точные результаты.

Схема реакций гексокиназного метода:

гексокиназа

Глюкоза + АТФ --------------> глюкозо-6-фосфат + АДФ

гл-6-Ф-ДГ

Глюкозо-6-Ф + НАДФ ---------------> 6-фосфоглюконат + НАДФ*Н ( Е340)

Достоинства

Наивысшая точность (референтный метод)

Простота анализа (монореагент) и его специфичность, отсутствие посторонних влияний

Недостатки

Необходимость предварительной депротеинизации и центрифугирования (при анализе цельной крови)

Работа только на анализаторах или фотометрах с УФ-диапазоном (340 нм) кинетическим методом

Для экспресс-определения глюкозы крови на тест-полосках (МЕЛЛИФАН и др.)

Также используется принцип глюкозооксидазного метода.

СВЕТ ИЛИ ТЬМА

По наборам с уреазно-фенолгипохлоритным методом довольно часто встречаются рекламации о потемнении фенол-нитропруссидного реагента. Причиной потемнения является фотолиз. В инструкции написано – хранить в темноте. В практике часто это выглядит так – утром достали флакон с этим реагентом из коробки, поставили на стол, и до конца рабочего дня, когда лаборант убирает рабочее место, реагент стоит на свету. После двух-трех таких сессий реагент можно выкидывать. Достали из темноты, внесли в пробирки и сразу убрали в темноту, и не будет никаких проблем.

ТЕПЛО ХОЛОДНО

Аналогичная ситуация наблюдается при использовании кинетических методов для определения трансаминаз. Рабочий реагент стабилен до 14 суток при непрерывном хранении в холодильнике. Если он 6-8 часов стоял на рабочем столе, то через два дняон выйдет из строя. Рекомендации те же, сразу после использования убрать рабочий реагент в холодильник. Соблюдение температуры и срока хранения.