Метод биологической оценки на голубях

Отбор голубей и их содержание

Для опытов отбирают беспородных здоровых голубей массой 280 - 400 г, находившихся в условиях лабораторного содержания в течение 5 - 7 суток. За 18 - 24 ч до начала опыта птиц лишают пищи, но не воды.

Техника испытания и принцип расчета.

Опыт проводят под легким тиопентал - натриевым наркозом (35 мг/кг внутримышечно в лапку).

Наркотизированных голубей привязывают к станку для мелких животных в положении на спине таким образом, чтобы голова голубя находилась ниже туловища (во избежание попадания в дыхательные пути слизи и рвотных масс). С внутренней стороны крыла удаляют перья, находят и отсепаровывают вену крыла. В вену вводят металлическую канюлю (затупленная инъекционная игла N 19-22), соединенную тонкой каучуковой трубкой с градуированной бюреткой вместимостью 5 мл, имеющей деления 0,05 мл. Бюретку предварительно наполняют раствором испытуемого ЛС, приготовленным на 0,9% растворе натрия хлорида.

Испытуемый раствор вводят отдельными дозами по 0,3 мл через каждые 5 минут до наступления остановки сердца голубя. Остановку сердца определяют по характерному изменению положения головы и шеи голубя и контролируют последующим вскрытием грудной клетки. Длительность опыта должна составлять не менее 65 и не более 95 минут. Голуби, смерть которых наступает в другие сроки, в расчет не принимаются. В течение опыта голубю вводят не менее 13 и не более 19 доз (0,3 мл) испытуемого раствора. Испытание обычно проводят на 6 голубях.

Результаты опытов могут быть использованы для расчета биологической активности лишь в том случае, если в одной и той же серии опытов расхождение между максимальными и минимальными числами введенных доз не превышает 4, а общее число доз не выходит за установленные пределы (13-19). В противном случае увеличивают количество подопытных голубей или повторяют опыт с новой концентрацией испытуемого раствора.

Оценку активности испытуемых ЛС можно проводить двумя способами: 1) по сравнению со стандартным образцом; 2) в голубиных единицах действия.

а) Оценка активности испытуемого ЛС по сравнению со стандартным образцом.

В опыт берут не менее 12 голубей — по 6 голубей для стандартного образца и испытуемого ЛС. Данные, полученные при биологическом испытании стандартного образца, могут быть использованы для расчета и последующих опытов в течение 30 суток без повторного испытания.

Из полученных в опыте со стандартным или испытуемым ЛС данных вычисляют величину смертельной дозы ЛС для каждого голубя в миллилитрах на 1 кг массы.

б) Определение активности испытуемого ЛС в ГЕД.

Для выражения активности испытуемого ЛС в голубиных единицах действия (ГЕД) расчет проводят для каждого голубя по формуле:

,

где К — разведение испытуемого ЛС; m - масса голубя в килограммах; а — доза разведенного ЛС в миллилитрах.

Из данных, полученных в опытах, выводят среднее число ГЕД и вычисляют в процентах отклонение отдельных опытов от среднего числа.

Сведения о требуемом содержании ЛЕД, КЕД и ГЕД в отдельных ЛС и растительном сырье, а также методики их определения приведены в соответствующих фармакопейных статьях.

● Химические методы. Длительность, трудоемкость, строго установленные условия биологических методов испытаний ЛРС и ЛС, содержащих сердечные гликозиды, побудили исследователей к поиску адекватных химических методов. В НД конкретно указывается, в каких случаях применяется биологическая стандартизация, и в каких –количественное определение сердечных гликозидов химическим путем. Так, например, в случае производства ЛС ланатозида в листьях наперстянки шерстистой определяют биологическую активность, а при получении ЛС целанида в сырье химическим методом определяют сумму дигиланидов (ланатозидов) А, В и С. Принцип химического метода заключается в следующем. Из навески сырья гликозиды экстрагируют 80% метанолом (1:10). Экстрагент отгоняют, вытяжку очищают путем встряхивания с тетрахлометаном; гликозиды переводят в смесь хлороформа с изопропиловым спиртом. Извлечение сгущают досуха, гликозиды растворяют в точном объеме смеси хлороформа и метанола, и полученный раствор хроматографируют на бумаге. Подвижная фаза: хлороформ – диоксан – н-бутанол, насыщенная формамидом. Вырезанные участки бумаги с пятнами гликозидов помещают в одинаковые объемы ксантгидролового реактива. Полученные растворы колориметрируют на ФЭК-М. По калибровочному графику находят концентрацию для каждого дигиланида (ланатозида) в миллиграммах в 1 мл раствора, после чего рассчитывают сумму дигиланидов, которых должно быть не менее 1%.