Метод биологической оценки на лягушках

Отбор лягушек и их содержание

Для опытов пригодны лягушки - самцы вида травяная (Rana temporaria) массой 28-40 г; водяная - озерная (Rana ridibunda) и прудовая (Rana esculenta) массой 30-70 г.

Лягушек содержат в течение зимы в бассейне с проточной водой в полутемном помещении при температуре от 3˚С до 8˚С. Сохраняемые в бассейне лягушки зимой могут быть непосредственно использованы для опыта. Весной и летом лягушки должны быть свежепойманными и выдерживаться до опытов в бассейнах с проточной водой в течение 2-3 суток. Температура воды в бассейне в теплое время года не должна превышать 15˚С. Помещение лаборатории, где проводят биологические испытания, должно быть светлым, но защищенным от попадания прямых солнечных лучей, температура воздуха в нем 15-22˚ С. В лаборатории должна быть раковина для содержания подопытных лягушек, в которую их помещают за 1-1,5 ч до проведения опыта.

Техника испытания и принцип расчета.

Отбирают партию лягушек одного вида, близких друг к другу по массе. Взвешивание животных проводят непосредственно перед опытом с точностью до 0,5 г с отклонениями от средней массы в группе не более чем на ±2,5 г: 28-33, 30-35, 35-40... 65-70 г. Лягушек (5 или 10 штук) укрепляют на досках брюшком кверху с предельно вытянутыми конечностями, булавки вкалывают в верхнюю часть морды и в суставы передних и задних конечностей. Пинцетом захватывают кожу на груди и вырезают в ней прямоугольное отверстие. Вырезанный лоскут кожи откидывают в сторону. При этом становится отчетливо видимой грудина, просвечивающая через мышцы в виде белой пластины, напоминающей по форме песочные часы. Приподняв пинцетом грудину в узкой части, тонкими ножницами перерезают ее поперек выше и ниже места наложения пинцета, так что образуется узкое поперечное оконце, через которое видны дуги аорты и предсердия. Тонким (глазным) пинцетом проникают в разрез (осторожно, чтобы не поранить предсердия и крупные сосуды), слегка вытягивают сердечную сорочку и рассекают ее ножницами. Затем легкими надавливаниями на брюшко лягушки выводят сердце наружу. При препарировании следят за тем, чтобы через образованное отверстие не выступали наружу печень и легкие и чтобы сердце свободно помещалось на лишенном кожи участке, не прикасаясь к наружной поверхности кожи. В течение опыта обнаженное сердце каждые 15-20 минут смачивают 0,6% раствором натрия хлорида (наносят пипеткой 2-3 капли).

Испытания на травяных лягушках следует проводить, вводя растворы в лимфатические бедренные мешки (под кожу), в сердце (в полость желудочка), на водяных – в сердце (в полость желудочка) или в вену; под кожу – только растворы, содержащие гликозиды ландыша.

Лягушкам, относящимся к одной группе (5 штук), вводят одинаковые дозы испытуемого раствора. ЛС, подлежащие испытанию, предварительно разводят водой с таким расчетом, чтобы 0,3 или 0,4 мл испытуемого раствора соответствовали 1 ЛЕД. Для этого среднее количество единиц действия ЛС умножают на количество миллилитров, соответствующее 1 ЛЕД. Например, в 1 мл раствора коргликона 0,06 % для инъекций содержится в среднем 13,3 ЛЕД (13,3 х 0,3 = 3,99, т. е. разведение ЛС 1:4).

а) Метод испытания при введении под кожу.

Растворы вводят шприцем с тонкой иглой в бедренные лимфатические мешки лягушек. Дозы, не превышающие 0,35 мл, вводят в одну конечность, большие дозы (но не более 0,7 мл) вводят равными частями в обе конечности. После введения раствора наблюдают за лягушками и определяют наименьшую дозу, вызывающую систолическую остановку сердца у большинства (3-4) из 5 лягушек данной группы в течение 1 ч, если испытывают сырье и ЛС наперстянки, ландыша, горицвета, или в течение 2 ч, если испытывают сырье и ЛС строфанта. Если в течение этого времени отчетливой остановки сердца не произошло, продолжают наблюдение еще 10 минут (при длительности наблюдения 1 ч) и учитывают также количество лягушек, у которых остановка сердца наступила в дополнительное время. Длительность систолической остановки сердца должна быть не менее 15 минут. Лягушек, у которых сердце начинает вновь сокращаться ранее, чем через 15 минут после остановки, в расчет не принимают. В протоколах опытов отмечают время введения ЛС и результаты опытов для каждой лягушки в отдельности. Каждое отдельное испытание начинают с определения чувствительности данной партии лягушек к стандартному образцу. С этой целью нескольким группам лягушек по 5 животных в каждой вводят разные дозы стандартного образца: одной группе — дозу, соответствующую 1 ЛЕД (по 0,3 или 0,4 мл в зависимости от того, какой применяется стандарт), другим — на 0,05-0,1 мл больше. Находят наименьшую дозу стандартного образца, вызывающую остановку сердца у большинства (3-4) из 5 лягушек, и устанавливают таким образом чувствительность опытной партии лягушек по сравнению со стандартными лягушками. Затем в тех же условиях опыта группе из 5 лягушек той же партии вводят раствор испытуемого ЛС в дозе, соответствующей найденной наименьшей дозе стандартного образца, и наблюдают за животными в течение 1 или 2 ч (в зависимости от того, какой ЛС испытывается). Если в результате наблюдений будет установлено, что введенная доза недостаточна или слишком велика, дозу увеличивают или уменьшают, причем разница между дозами должна быть не более 0,1 мл. Опыты проводят до тех пор, пока не будет найдена наименьшая доза испытуемого ЛС, вызывающая систолическую остановку сердца у большинства (3-4) из 5 лягушек.

Далее рассчитывают содержание единиц действия в 1 мл, 1 г или 1 таблетке испытуемого ЛС.

Для сырья и ЛС наперстянки, ландыша, горицвета расчет проводят по формуле:

,

где А — наименьшая доза в миллилитрах, установленная для раствора испытуемого ЛС; В — наименьшая доза в миллилитрах, установленная для раствора стандартного образца; 0,3 — доза в миллилитрах, соответствующая 1 ЛЕД; К — число, обозначающее разведение испытуемого ЛС.

Для сырья и ЛС строфанта расчет проводят по формуле:

б) Метод испытания при введении в полость желудочка сердца.

Испытуемые растворы, предварительно освобожденные от избытка спирта (не должен превышать 10%) и летучих веществ, в соответствующем разведении вводят лягушкам непосредственно в полость желудочка сердца со скоростью 0,1 мл в 5 секунд, проколов его в момент диастолы тонкой иглой, соединенной со шприцем вместимостью 1 мл с двойной шкалой (деления 0,01-0,02 мл). Иглу вынимают из полости желудочка во время систолы, чтобы избежать кровотечения в месте укола. Для определения наименьшей дозы раствора стандартного образца и испытуемого ЛС травяным лягушкам вводят примерно 0,2 мл ЛС наперстянки, ландыша, горицвета или 0,3 мл ЛС строфанта. Допустимое отклонение между вводимыми дозами — 0,02-0,03 мл.

Длительность наблюдения за лягушками — 15 минут, если испытывают сырье и ЛС наперстянки, ландыша, горицвета; для ЛС строфанта — 20 минут. Если в течение этого времени отчетливой остановки сердца не произошло, наблюдение продолжают еще 5 минут. Лягушек, у которых сердце начинает вновь сокращаться ранее, чем через 5 минут после остановки, в расчет не принимают.

Вычисляют содержание ЛЕД в 1 мл, 1 г, в 1 таблетке испытуемого образца по формулам, приведенным для подкожного введения, но обозначения А и В зависят от принципа расчета доз, т. е. от вида применяемых лягушек: А — наименьшая доза (1 мл на массу травяной лягушки или 1 мл на 1 г массы водяной лягушки), установленная для раствора испытуемого ЛС; В — наименьшая доза (1 мл на массу травяной лягушки или 1 мл на 1 г массы водяной лягушки), установленная для раствора стандартного образца.

в) Метод испытания при введении в вену.

У лягушек проводят поперечный разрез кожи на уровне ключиц, затем по средней линии живота до симфиза, где надсекают кожу вправо и влево. Образовавшиеся лоскуты кожи отводят в стороны. На внутренней поверхности отведенных в сторону лоскутов кожи с каждой стороны видна большая кожная вена в виде петли, идущей по поверхности прямой мышцы живота от кожи спины книзу, а затем снова вверх, где она впадает в верхнюю полую вену. Затем выводят наружу сердце аналогично методу испытания при введении под кожу. Доску с группой препарированных животных поворачивают так, чтобы головы лягушек были обращены к экспериментатору для удобства введения иглы в нисходящее колено петли вены лягушки. Лягушкам, относящимся к одной группе (5 штук), вводят в вену одинаковые дозы раствора стандартного образца или испытуемого ЛС тонкой иглой, соединенной со шприцем вместимостью 1 мл с двойной шкалой, со скоростью 0,1 мл в 5 секунд. После каждого введения накладывают кровоостанавливающие зажимы, которые не снимают до конца опыта. Время наблюдения за остановкой сердца лягушки 15 минут, если испытывают сырье и ЛС наперстянки, ландыша, горицвета; для ЛС строфанта — 20 минут. Если в течение этого времени отчетливой остановки сердца не произошло, наблюдение продолжают еще 5 минут; о результатах судят по изменениям, наступающим в дополнительное время.

Определение наименьшей дозы стандартного образца и испытуемого ЛС, вызывающей систолическую остановку сердца у большинства лягушек (3-4) из 5, проводят так же, как при введении под кожу.

Допустимое отклонение между вводимыми дозами должно быть не более 0,0005 мл на 1 г массы лягушки.

Наименьшими дозами обычно являются 0,004 - 0,006 мл раствора на 1 г массы лягушки.

Вычисляют содержание ЛЕД в 1 мл, 1 г или 1 таблетке испытуемого ЛС по формулам, приведенным для подкожного введения, но с другими обозначениями А и В: А — наименьшая доза (1 мл на 1 г массы лягушки), установленная для раствора испытуемого ЛС; В — наименьшая доза (1 мл на 1 г массы лягушки), установленная для раствора стандартного образца.