Выбор концентраций мономеров

Для удобства изложения используются следующие обозна-
чения: Т — процентное отношение суммарной массы обоих мо-
номеров к объему их раствора, С — процентное отношение мас-
сы метиленбисакриламида к общей массе обоих мономеров. Ве-
личина Т практически варьирует в пределах 3 — 30%, а С, как
правило, составляет 1—5%, что соответствует отношению акри-
ламид/Бис в пределах от 99 : 1 по 19 : 1. Однако в некоторых
особых случаях, рассмотренных ниже, имеет смысл увеличивать
С до 20% и более. При указании значений Т и С значок «%» да-
лее будет опущен.

Чем же диктуется выбор значений T и С? Прежде всего, на
этот выбор накладывают ограничения механические и адсорб-
ционные свойства геля. Например, гели с T £ 5 и С = 1 оказыва-
ются слишком мягкими и липкими — их невозможно извлечь
из стеклянной формы. Для крупнопористых гелей надо увели-
чивать степень сшивки (повышать величину С до 3 — 5), т. е. от-
ношение акриламид/Бис брать в пределах от 35 : 1 до 20 : 1. При
этом происходит одновременное повышение прочности геля и
ухудшение его способности прилипать к стеклу — гель как бы
«замыкается». Мелкопористые гели (T около 20) при высоком
содержании «сшивки» оказываются хрупкими и мутными, по-
этому для них величина С не должна превышать 1 — 2.

На первый взгляд кажется очевидным, что поры ПААГ тем
мельче, чем больше содержание в нем мономеров, т. е. величи-
на Т. Но это не всегда так; имеет смысл разобраться в этом
глубже.

Неправильно было бы считать ПААГ регулярной простран-
ственной решеткой с жесткими ячейками определенного средне-
го размера. При малых значениях С он представляет собой ско-
рее длинные нити, заполняющие весь объем и лишь в отдельных
точках случайным образом сшитые между собой. Расстояние
между этими точками вдоль нити (при C £ 2) в среднем равно
50 — 100 мономерных единиц. Такая система не может быть
внутренне жесткой. Мигрирующие в геле макромолекулы, по-
видимому, могут раздвигать гибкие длинные участки линейных
полимеров акриламида. Разумеется, на это расходуется энер-
гия, миграция молекул замедляется и происходит своеобразное
«трение» их о гель. Однако жестких ограничений на размер

мигрирующих молекул такая система не накладывает, и это
очень существенно.

Чем больше содержание акриламида(а величина Т, в основ-
ном, определяется им), тем гуще нити полимера, меньше проме-
жутки между ними и сильнее трение. Увеличение содержания
«сшивки» (С) сначала повышает жесткость геля так как сред-
няя длина свободных участков нитей уменьшается. Трение при
этом увеличивается, а миграция биополимеров в геле замедля-
ется, — именно этого и можно было ожидать. Однако далее кар-
тина меняется. Эксперимент обнаруживает, что с увеличением
С выше 10 тормозящий эффект геля (при одних и тех же значе-
ниях Т) ослабляется. При С > 15 гель ведет себя как крупнопо-
ристый даже при высоких значениях Т. Дело в том, что внутрен-
няя структура геля в этом случае приобретает, по-видимому,
совсем иной характер. Благодаря частым сшивкам, располо-
женным теперь на расстоянии всего лишь нескольких мономер-
ных единиц друг от друга, оказывается энергетически выгодным
и вероятным многократное связывание нескольких параллельно
идущих нитей в своего рода пучки, которые также образуют
хаотически сшитую пространственную сетку. Однако эта сетка
оказывается действительно жесткой — нити в пучках раздвинуть
невозможно. Зато между пучками полимерных нитей образу-
ются достаточно большие пустоты, заполненные жидкой фазой
геля, по которым могут свободно мигрировать молекулы биопо-
лимеров.

Между прочим, такая же ситуация возникает и при затверде-
вании агара или агарозы, однако нити линейных полисахаридов
связываются в пучки не ковалентными, а водородными связями.
Такая структура и обеспечивает удивительное сочетание круп-
нопористости и прочности, характерное для этих гелей.

Возвращаясь к ПААГ, следует указать, что гели с очень вы-
соким содержанием метиленбисакриламида (С > 15) хрупки,
легко отстают от стенок, непрозрачны и сильно окрашиваются.
Этих недостатков лишены гели, сшитые NN^/-диaллилтapтapдиa-
мидом. Например, гель с T = 5 и С = 15, сшитый ДАТД, оказы-
вается настолько крупнопористым, что не тормозит миграцию
биополимеров с молекулярной массой 0,5 млн. дальтон; при
этом он механически прочен, хорошо сцепляется со стеклом и
прозрачен [Baumann, Chrambach, 1976]. Вспомним, что такой
гель к тому же растворим в йодной кислоте. Недавно описано
успешное использование для электрофореза белков еще сильнее
сшитого геля этого типа. В нем величина С достигала 27, т. е.
отношение акриламид/ДАТД не превышало 4 : 1 [Spath, Koblet,
1979].

Рассмотрим теперь подробнее влияние выбора значений Т и
С для обычного ПААГ на скорость миграции в нем биополиме-
ров. Тормозящий эффект трения о гель проявляется в снижении
электрофоретической подвижности заряженных макромолекул в
геле (и') по сравнению с их подвижностью в свободной жидко-

сти с такими же, как у буфера геля, значениями рН и ионной си-
лы раствора (u₀). Электрофоретическую подвижность определя-
ют как величину скорости миграции заряженных молекул (см/ч)
при напряженности поля 1 В/см. Величина и₀ зависит от соотно-
шения суммарного электрического заряда макромолекулы (при
данном рН) и ее массы. Сила, действующая на молекулу в элек-
трическом поле, пропорциональна заряду, а противодействую-
щая миграции вдоль силовых линий поля сила трения о жид-
кость пропорциональна линейному размеру молекулы, а следо-
вательно, кубическому корню из ее массы. Для ориентировки
заметим, что электрофоретическая подвижность большинства
кислых белков в свободной жидкости при рН 8,8 лежит в пре-
делах 0,1 — 0,5 см/ч на 1 В/см. Прямой корреляции между мас-
сой молекулы и величиной и₀, очевидно, быть не должно.

В геле трение существенно возрастает, причем тем сильнее,
чем больше масса молекул и меньше средний размер пор, т. е.
чем больше величина Т (для малых значений С). Показано, что
имеет место соотношение: ln(и'/и₀) = — k_RT. Величина коэффи-
циента торможения k_R (порядка 0,1— 0,4) зависит от среднего
радиуса молекулы R и степени сшивки геля С, слабо увеличи-
ваясь с ростом последней в пределах от 1 до 7. Для глобуляр-
ных белков R лежит в диапазоне от 1,57 нм для лактальбумина
(M = 12400) до 3,61 нм для церулоплазмина (M = 151 000).

Для эффективного разделения белков при электрофорезе в
ПААГ соотношение u'/u₀ должно составлять 0,1 — 0,2. Отсюда
следует, что оптимальная электрофоретическая подвижность
белков в ПААГ лежит в пределах 0,01— 0,1 см/ч на 1 В/см. При
напряженности поля 10  —  20 В/см этому соответствуют скорости
миграции белков в диапазоне 0,1 — 2 см/ч. Таким образом, при
рабочей длине геля 10 см за 5 ч электрофореза наиболее быст-
рые белки могут достигнуть конца геля, в то время как наименее
подвижные продвинутся лишь на 0,5 см. Цифры эти — сугубо
приближенные и приведены здесь лишь для общей ориентиров-
ки. В конкретных случаях возможны существенные отклонения
от них. Например, если заранее известно, что разделяемые бел-
ки сильно различаются между собой по заряду или размерам, то
можно вести электрофорез в условиях более высоких подвижно-
стей (и'), т. е. в более крупнопористых гелях, и тем сократить
время фракционирования в 2 — 3 раза.

Выбор значения Т зависит от природы различия электрофо-
ретических подвижностей белков в геле. Если сильно различа-
ются размеры молекул, а отношение заряда к массе у них более
или менее одинаково, то имеет смысл выбрать Т максимальным.
Разделение в этом случае будет происходить только за счет
трения о гель, причем тем эффективнее, чем больше Т, хотя при
этом в связи с увеличением продолжительности электрофореза
усилится диффузия белков. Если же компоненты анализируемой
смеси имеют различные отношения заряда к массе, то может
оказаться выгодным вести разделение в крупнопористом геле

при малых значениях Т), т. е. как бы в свободной жидкости,
почти не используя эффект трения молекул о гель. По крайней
мере, это обеспечит выигрыш во времени фракционирования.

Ориентировочно о характере различия электрофоретических
подвижностей двух белков в данных условиях разделения мож-
но судить в том случае, когда известны их молекулярные мас-
сы и изоэлектрические точки, а также содержание в них ионо-
генных аминокислот. Чаще всего бывают, хотя бы приблизитель-
но, известны молекулярные массы. Если они различаются не-
значительно, то имеет смысл ориентироваться сначала на круп-
нопористый гель и попробовать поварьировать рН буфера.

Пожалуй, самый существенный вывод из проведенного каче-
ственного рассмотрения — заключение об определенной свобо-
де выбора концентрации ПААГ и, особенно, содержания в нем
«сшивки» (С в пределах 2 — 5). В любом случае выбор значений
Т должен быть сделан на основе ряда пробных опытов, в кото-
рых, в частности, следует варьировать рН буфера и продолжи-
тельность электрофореза (электрофорез белков в присутствии
додецилсульфата натрия пока не рассматривается).

В качестве сугубо ориентировочной можно рекомендовать
следующую полученную на практике таблицу соответствия мо-
лекулярных масс разделяемых белков (М) и концентраций
ПААГ(Т):

Приступая к электрофоретическому фракционированию био-
полимеров, необязательно в точности воспроизводить значения
Т и С, приведенные в литературе для сходного типа эксперимен-
тов, но выбранные однажды условия следует, разумеется, точно
воспроизводить в собственной серии опытов для надежной иден-
тификации и сопоставления положения соответствующих полос.