Рентгеноструктурний аналіз

Головною технікою, яка дозволяє встановити просторову структуру макромолекули з роздільною здатністю до кількох ангстремів, є рентгеноструктурний аналіз. Об’єктом аналізу є кристал, у складі якого однакові макромолекули чи макромолекулярні комплекси утворюють впорядковану тривимірну решітку. Кристали, придатні для рентгеноструктурного аналізу (розміром щонайменше 0,3 мм), готують із перенасичених розчинів макромолекул, контролюючи швидкість зростання кристала за рахунок варіювання концентрації солі, температури, додаючи органічні розчинники тощо. У кристалах білків і нуклеїнових кислот, як правило, залишається значна кількість упорядкованих молекул води.

Вузький рентгенівський промінь буде частково розсіюватись на атомах кристала. Оскільки групи атомів періодично повторюються у кристалі, розсіяні промені будуть інтерферувати між собою, підсилюючи один одного в певних точках на детекторі, що реєструє рентгенівські промені після проходження їх крізь зразок. У результаті на детекторі формується впорядкований розподіл так званих рефлексів – точок високої інтенсивності.

Картина рентгенівського розсіювання містить інформацію щодо просторових позицій атомів у кристалі. Вилучення цієї інформації є досить складним математичним завданням, хоча сьогодні комп’ютерна техніка дозволяє аналізувати рентгенограми досить швидко: лімітуючим кроком рентгеноструктурного аналізу є практично вирощування кристалів.

Безпосереднім результатом аналізу рентгенограми є складна тривимірна карта електронної щільності. Інтерпретація цєї карти є можливою за умови, якщо послідовність біополімеру в складі кристала є відомою.

Шляхом численних підгонок на комп’ютері ця послідовність (чи послідовності кількох елементів досліджуваного комплексу) узгоджується з електронною картою, результатом чого є встановлення просторової координати кожного атома в макромолекулі. Саме таким шляхом отримано інформацію про структуру численних білків і міжмолекулярних комплексів.

Проте, як правило, великі макромолекули виявляються надто складними для того, щоб рентгенівське розсіювання на їхніх кристалах дозволило отримати тривимірну структуру. Для визначення структури більшості білків, нуклеїнових кислот і комплексів застосовують методізоморфних похідних, який потребує набору кристалів макромолекули: вихідний кристал і принаймні два – три кристали, які були б ідентичними, але містили б атоми важких металів, що значно інтенсивніше розсіюють рентгенівське світло. Важкі атоми вводять у кристал або шляхом дифузії важких металів у нього, або використовуючи мутантні форми білка. В останньому випадку методами спрямованого мутагенезу здійснюють заміну однієї амінокислоти на Cys, до SH-групи якого можна легко приєднати атом важкого металу. Таким чином, розвиток методів рекомбінантної ДНК та експресії рекомбінантних білків став важливою передумовою структурних досліджень: завдяки рекомбінантним технологіям стало можливим не тільки отримувати достатню кількість високоочищених білків, придатних для подальшої кристалізації, а й готувати їхні ізоморфні похідні. Порівняння рентгенограм, отриманих від немодифікованого кристала та його похідних, дозволяє врешті решт розрахувати структуру макромолекули.

Численні експериментальні результати свідчать, що структура макромолекули в кристалі, не тільки у своїх головних загальних рисах, а й у багатьох деталях, збігається зі структурою в розчині. Проте за рахунок сил кристалічної упаковки можливі деякі деформації просторової структури в кристалах. Крім того, кристал дає статичну картину молекулярної структури, не дозволяючи досліджувати конфірмаційну динаміку макромолекул за умов, наближених до фізіологічних. Тому важливим доповненням до рентгеноструктурного аналізу є різноманітні методи дослідження структури макромолекул у розчині.