Методи безпосереднього спостереження

Історично першим методом спостереження досить великих макромолекулярних комплексів із роздільною здатністю у манометровому діапазоні стала електронна мікроскопія. При застосуванні цього методу зразок розміщують у вакуумній камері мікроскопа, опромінюють променем електронів, який далі проектується на флуоресцентний екран. Зразок при цьому має бути «зафарбований» певною речовиною, непрозорою для електронів.

Одна з поширених технік полягає в тому, що макромолекули наносять на карбонову підкладку, практично прозору для електронного променя (як і макромолекули), і фіксують на ній. Потім підкладку промивають розчином солі важкого металу, наприклад уранілацетатом. Після висушування така підкладка стає непрозорою для електронів скрізь, крім ділянки, де розміщена макромолекула, й уранілацетат не зв’язався з підкладкою. Така техніка негативного контрасту дозволяє спостерігати під електронним мікроскопом молекули ДНК, комплекси ДНК із білками (такі як нуклеосоми), мультибілкові комплекси тощо. Розділення при негативному контрасті лімітоване розміром частинок важкого металу.

Важливим варіантом електронної мікроскопії, який дозволяє уникнути фіксації та контрастування зразка, є кріоелектронна мікроскопія. Тонкий шар (~100 нм) розчину макромолекул на підкладці швидко заморожується до –160 °C і при цій температурі розміщується в охолодженій вакуумній камері мікроскопа. Виявляється, що такі зразки дають достатньо високий рівень контрасту без додаткової обробки. Кріоелектронна мікроскопія відіграла важливу роль у дослідженнях структури та механізмів функціонування рибосоми.

Сучасною альтернативою електронної мікроскопії є мікроскопія атомних сил (AFM – Atomic Force Microscopy). Макромолекули адсорбуються на підкладці, після чого зразок може бути дослідженим як після висушування, так і в разі, коли залишається шар рідини.

Підкладка сканується голкою з надзвичайно тонким вістрям, яке за рахунок міжатомних (вандерваальсових) сил взаємодіє з поверхнею, відстежуючи її «ландшафт» (рис. 18). Рух голки реєструється оптичною системою (лазерний промінь, що віддзеркалюється від голки на фотодіод), і перетворюється комп’ютером у зображення поверхні. Роздільна здатність є порівнянною з такою електронного мікроскопа, однак, на відміну від електронної мікроскопії, AFM не потребує фіксації та контрастування зразка, дозволяє працювати з макромолекулами, що перебувають в умовах, близьких до фізіологічних. Крім того, існує можливість кількісної оцінки висоти зміщення голки відносно поверхні підкладки.

Рис. 18. Принцип мікроскопії атомних сил (AFM).