Імунопреципітація хроматину

Метод імунопреципітації (ChIP – Chromatin ImmunoPrecipitation) є потужним засобом установлення наявності білка на певній ділянці ДНК in vivo (рис. 17). Для цього клітини обробляють формальдегідом із метою ковалентного пришивання всіх білків до ДНК. Далі здійснюють лізис клітин, виділяють ДНК і частково її фрагментують. Ковалентні ДНК-білкові комплекси осаджують антитілами, специфічними до конкретного білка (або пропускають через колонку, на якій іммобілізовані антитіла). Отримані комплекси руйнують, видаляючи зшивку хімічним шляхом, і аналізують ДНК, яка була зв’язаною у клітині з даним білком.

Одним із варіантів аналізу може бути ампліфікація ДНК за допомогою ПЛР і наступне секвенування або гібридизація з міченим зондом.

Якщо, наприклад, зробити зшивання в різні моменти після регуляторного сигналу, то можна встановити послідовність зв’язування білків з регуляторними ділянками промотора певного гена.

Рис. 17. Імунопреципітація хроматину.

Якщо білок має численні сайти взаємодії в геномі, до всіх отриманих фрагментів ДНК пришивають промотор РНК-полімерази бактеріофага Т7 і за допомогою полімерази здійснюють транскрипцію in vitro – синтез РНК-копій фрагментів. Далі використовують ці РНК як матриці для зворотної транскрипції у присутності флуоресцентного аналога одного з NTP і отримані флуоресцентно мічені кДНК гібридизують з ДНК-мікроареєм, з’ясовуючи рівень присутності білка в різних ділянках геному.