Футпринтинг

Іншим підходом, який використовують для точної локалізації білка на фрагменті ДНК, є футпринтинг ДНК (DNA footprinting). Принцип методу схематично зображено на рис. 16. Кінець одного з ланцюгів мітять радіоактивною міткою. Зазвичай ³²Р у складі фосфатного залишку приєднується до попередньо дефосфорильованих 5′-кінців полінуклеотидкіназою, після чого один із кінців фрагмента відрізається рестриктазою (аналогічно відповідному етапу процедури на рис. 12).

Якщо внести в цю ДНК обмежену кількість одноланцюгових розрізів (наприклад, один розріз на фрагмент у середньому), отримаємо випадковий набір мічених фрагментів різної довжини, який можна розділити за допомогою гель-електрофорезу в денатуруючих умовах.

Як агенти, що вносять розриви, найчастіше використовують ДНК-азу І або гідроксилрадикали: обидва агенти розрізають один з ланцюгів ДНК через маленький жолобок. У випадку, коли з фрагментом ДНК взаємодіє білок, ДНК виявляється захищеною в сайті взаємодії: на гелі після електрофорезу можна побачити зону, де відсутні смуги ДНК, або інтенсивність смуг є нижчою порівняно з контрольним результатом деградації вільної ДНК. Довжини верхньої та нижньої смуг, які оточують цю зону, є межами сайта взаємодії відносно мітки.

Аналогічний підхід у комбінації з блот-гібридизацією (так зване непряме кінцеве мічення) дозволяє встановити ступінь захищеності ДНК білками в конкретних геномних зонах. Першим етапом процедури є обмежена деградація ДНК нуклеазою у клітинних ядрах. Після цього виділяють сумарну ДНК і обробляють її рестриктазою: у результаті препарат містить фрагменти ДНК від рестриктного сайта до місця розрізу нуклеазою. Усі ці фрагменти розділюють шляхом електрофорезу, здійснюють блотинг і обробляють нітроцелюлозний фільтр радіоактивно міченим зондом до певної ділянки генома. На авторадіограмі візуалізуються (або ні, якщо ДНК захищена білком) фрагменти ДНК з цієї зони.

Рис. 16. Футпринтинг ДНК у складі білковонуклеїнового комплексу.